基因组编辑技术概述

《基因组编辑技术概述》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、GenomeEditingTechnologyEdDavis,Ph.D.SeniorApplicationScientist,GeneCopoeia,Incorporated.摘要基因组编辑已经成为生物学和药学领域重要的研究手段（Bogdanove&Voytas,2011）。目前，最常用的两类基因组编辑技术：TALEN(TranscriptionActivator-likeEffectorNucleases)和CRISPR(Clustered,RegularlyInterspaced,ShortPalindromicRepeats).这两项技术都利用核酸内切酶切割基因组序列

2、以形成双链断裂（DSBs），并得以广泛应用，例如：基因敲除、基因敲入、基因标记和遗传缺陷的修复。此文中，我们将讨论和比较基因组编辑技术和应用。简介什么是基因组编辑？基因组编辑是对遗传密码实现永久性改变，这一点不同于RNA干扰（RNAi）。RNA干扰可引起基因下调“knockdown”（下调）或“Reduction”（减少），但并不能去除某一基因功能。基因组编辑的作用原理：首先形成位点特异的双链断裂，紧接着通过同源重组（HR）或非同源末端连接机制（NHEJ）进行修复（图1）。供体克隆与基因组发生同源重组，引入外源DNA片段，实现基因敲除和敲入；非同源末端连接即染色体末端重新连

3、接。NHEJ易于发生插入或缺失后的移码错误。www.igenebio.com图1.基因组编辑中双链断裂形成原理。左：非同源末端链接；右侧：同源重组。基因组编辑技术TALENTALs是存在于植物细菌的DNA结合蛋白（Bogdanove&Voytas,2011）。与DNA的结合由34bp氨基酸重复序列中的连续两个氨基酸决定。这两个不保守的氨基酸被命名为“RepeatVariableDiresidue”（RVD）。RVD作为密码子与一个核苷酸结合（图2）。www.igenebio.com图2.TALEN中结合DNA的密码子.选自Bogdanove&VoytasTALEN包含2个D

4、NA结合蛋白，分别与Fok1核酸内切酶相融合。Fok1形成二聚体才有活性，因此，当两个TALs分别与靶序列的两条链结合时，Fok1特意切割目的序列形成双链断裂（DSB），DSB再经NHEJ或HR被修复。CRISPR对于CRISPR,S.pyogenesCas9核酸酶与singleguideRNA(sgRNA)相结合，sgRNA是一段包含20个核苷酸的序列。Cas9-sgRNA复合物识别尾端带有5’N-G-G3’“PAM”位点的基因组序列，并迅速形成双链断裂（图3）。图3.Cas9在sgRNA的引导下靶向作用于靶位点。标红的序列：sgRNA，标蓝的序列：靶序列，红色条状标记：

5、PAM，sgRNA的靶序列与PAM位点的互补序列互补，红色箭头：DNA序列切割位点。基因组编辑的应用基因组编辑的应用前景是可观的。以基因敲除为例，TALEN或CRISPRsgRNAs靶向靠近ATG的蛋白编码区域，可能引起不同长度的删除（图3）。www.igenebio.com图4.TALEN活性导致特异靶位点处的序列插入或敲除基因敲除也可通过同源重组插入筛选标记或示踪基因来实现（图5）。供体与TALEN对或Cas9/sgRNAs一同被引入到目的细胞。通过抗药性筛选，获得抗药性单克隆，进一步筛选插入正确的克隆。图5.利用供体质粒敲除小鼠的Sry基因。图为带有GFP、抗嘌呤霉素

6、基因的供体质粒，该质粒带有同源臂，与TALEN一起被引入细胞后，导致基因组特异位点处发生插入。来自Wang,etal.www.igenebio.com其余的基因组编辑应用需要同源重组。单个碱基的改变可通过供体质粒或单链寡核苷酸（singlestrandoligonucleotide,ssODN）来实现。这一方法早被用于引起小鼠白内障的突变修正（Wu,etal.,2013;图6）。图6.在转基因鼠上用CRIPSR和ssODN治愈遗传性的白内障病症。来自Wu,etal.TALEN与CRISPR，选哪一个？TALEN和CRISPR都是高效基因组编辑工具，但各有自身限制。TALEN

7、对胞嘧啶甲基化敏感；而CRISPR对甲基化不敏感。TALEN的效率比CRISPR低，但TALEN导致脱靶突变的可能性更低，即使双切口酶、截短了的guideRNAs和Cas9-Fok1融合体可提高CRISPR的特异性。结论基因组编辑是分子生物学史上革命性的创新。TALEN和CRISPR的操作简单和低成本使研究者更加容易创建实现了预期基因组改变的稳定细胞株和转基因动物。参考文献Bogdanove&Voytas(2011).Science333,1843.Ran,etal.(2013).NatureProtocols8,