课题3血红蛋白的提取和分离1

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1、课题3血红蛋白的提取和分离专题5DNA和蛋白质技术2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代和蛋白质组时代。对蛋白质的研究和应用，首先要得到纯净的蛋白质。在本课堂中，我们就一起来学校蛋白质的提取和分离。蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考一、基础知识：㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构

2、成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：根据被分离蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离的方法。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快凝胶色谱法分离蛋白质的原理1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱

3、或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡缓冲溶液：2、作用：能够抵制（）的对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值3、缓冲溶液的配制通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内思考：说出人体血液中缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3㈢电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用

4、缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度一定的PH分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（）通常用十二烷基硫酸钠

5、（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量分子的大小思考人们用鸡的红细

6、胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。样品处理—粗分离—纯化—纯度鉴定蛋白质的提取和分离一般分为四步：二实验操作1.样品血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）两个a－肽链两个β一肽链共四条肽链90％每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。（一）样品处理1、红细胞的

7、洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤，重复三次直至上清液不再呈现黄色。2、血红蛋白的释放：3、分离血红蛋白溶液：4、透析：红细胞的洗涤（一）样品处理1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：分离血红蛋白溶液

8、有机溶剂无色透明的甲苯层脂类物质白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液红色透明液体红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物（一）样品处理1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。透析过程视频（3.38