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《大肠杆菌不耐热肠毒素lt基因双价植物表达载体的构建 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体的构建祝建波史芳芳王冬梅周鹏【关键词】大肠杆菌;,不耐热毒素LT;,植物疫苗;,载体构建, [摘要]目的:构建可高效表达不耐热肠毒素LT的双价植物表达载体。方法:采用PCR的方法从强致病菌株中K88ac中,分别克隆了LTA和LTB基因,将LTA和LTB基因同时连接到植物表达载体pBI121上。结果:成功构建了带有内质网滞留信号RDEL/KDEL的不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300LTALTB。结论:构建的双价植物表达载体pCAMBIA
2、2300LTALTB,为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。 [关键词]大肠杆菌;不耐热毒素LT;植物疫苗;载体构建 添加免疫佐剂是提高免疫反应强度的有效方法,在非植物疫苗中已经被多次证实。在植物疫苗中,在抗原基因转入的同时加入免疫佐剂的基因,使转基因植物在表达抗原蛋白的同时也表达免疫佐剂,应是提高转基因植物口服疫苗免疫反应性的可行策略之一[1]。不耐热肠毒素(heatlabileenterotoxin,LT)是肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigen
3、icEcoli,ETEC)分泌的一种热不稳定性肠毒素,由A、B两种亚单位组成的AB5型杂六聚体蛋白,是目前人们发现的最强有力的黏膜免疫原和黏膜免疫佐剂之一。动物免疫实验证实,LT全毒素分子明显比B亚单位五聚体有更强的免疫原性。研究发现,单独的LTB与靶抗原同时口服后,佐剂作用不明显,而微量全毒素LT同抗原共同口服后,表现出很强佐剂作用[2]。当前,对减毒LT在烟草植物叶绿体中的表达已有研究[3],但对大肠杆菌肠毒素LT在植物胞质中的表达还未见报道。本研究旨在从K88ac强致病菌株中克隆LTA、LTB基因,构建成
4、双价植物高效表达载体,最终通过转基因植物来研究其在植物胞质中组装成AB5六聚体的效率,为进一步研究类LT全毒素传输疫苗载体打下了基础。 1材料和方法 1.1材料EcoliDH5α菌株,pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pBI121及pBLG载体,均为本实验室保存。限制性内切酶和T4DNA连接酶为宝生物公司产品,TaqDNA聚合酶及pGMTEasy载体等为北京天为时代公司产品。 1.2方法 1.2.1LTA、LTB基因的克隆采用碱裂解法从K88ac菌株中提取质粒。按照GenBank中的elt
5、A(V00275)和eltB(M17874)的成熟肽LTA、LTB基因序列,采用Primer50引物设计软件,设计相应引物。引物由上海申工DNA合成部合成。扩增LTA基因的引物序列,P1为:5＇GGATCCATGCTCGAGAATGGCGACAGATTATAC3＇,P2为:5＇GAGCTCTTATAATTCATCCCGGATTCTGT3＇;扩增LTB基因的引物序列,P3为:5＇CTCGAGATGAATAAAGTAAAATGTTATG3＇,P4为:5＇GTCGACTTATAGTTCATCTTTGTTTTTCATA
6、CTGATTGC3＇。为了方便构建植物表达载体,在扩增LTA基因序列的上游5＇端引物设计中,引入了BamHI酶切位点,在下游5＇端引入SacI酶切位点,并将LTA基因的终止密码子突变为（TGA→TAA）。同时,按同义密码子将LTA基因末端的EcoRI酶切位点进行了A→G突变(见引物G)。在扩增LTB基因序列的上游5＇端引物引入了XhoI酶切位点,在下游5＇端引入SalI酶切位点,并将LTB基因的终止密码子进行突变（TAG→TAA）。扩增LTA及LTB基因的反应体系为:10×buffer2μL、25mmol/LM
7、gCl21μL、dNTP(25mmol/L)02μL、上游引物05μL、下游引物05μL、DNA模板05μL、TaqDNA聚合酶05μL、ddH2O148μL,总体积为20μL。PCR的反应程序为:94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,共30个循环后再于72℃,延伸7min。PCR产物的回收按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒产品的说明书进行;目的基因与T载体的连接按pGMT连接试剂盒和克隆试剂盒产品说明书进行。连接产物转化E.coliDH5α的感受态细胞,通过蓝白斑筛选,挑取阳性克隆提取质粒,用B
8、amHI/SacI双酶切LTA/TVector,用BamHI/SalI双酶切LTB/TVector,分别获得744bp和375bp的阳性克隆进一步作DNA序列测定(测序由上海生工测序部完成)。 1.2.2LTA/pBI121、LTB/pBLG植物表达载体构建用BamHI/SacI双酶切克隆载体LTA/TVector和载体pBI121,分别回收目的基因条带和载体的大片段;用T4DNA连
