大豆KTi基因和BBi基因双价RNAi表达载体的构建-论文.pdf

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1、技术Technique·油脂工程大豆KTi基因和BBi基因双价RNAi表达载体的构建付永平’宋冰’-王丕武’夏海峰·。高玮a(1．吉林农业大学农学院2．吉林市农业科学院3．通化市农业科学院)【摘要】以KTi基因的ihpRNA种子特异性表达栽体p7~xP—GUS—KTiS为模板．采用PCR技术克隆含有KTi基因的完整ihpRNA构件，并将其克隆到pMD18一T载体．对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析，并进行序列比对；然后以BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体p7aP—GFP—BBiS为基础．利用限制性内切酶BstXI单酶切

2、，将KTi基因的完整ihpR2qA构件连入其中。最后利用冻融法转化根癌农杆菌，并进行PCR鉴定。结果表明：PCR扩增得到含有KTi基因的完整ihpRNA构件．构建成重组克隆载体pMD18一T—KRNAi，并构建成双价ihpRNA种子特异性表达载体pKTi—BBi—RNAi，并转化得到含有pKTi—BBi—RNAi的农杆茵EHA105。成功构建同时具有大豆胰蛋白酶抑制剂KTi基因和BBi基因的双价KNAi种子特异性表达载体，KTi基因和BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入农杆茵中。【关键词】大豆；胰蛋白酶抑制剂KTi基因；BBi

3、基因；RNAi表达栽体；种子特异性启动子中图分类号：TS201．2文献标识码：A文章编号：1000—9868(2012)08—0074一O4大豆蛋白酶抑制剂有Kunitz型胰蛋白酶抑制剂酶和胰凝乳蛋白酶在独立的反应部位产生抑制。胰蛋白(Kunitztrypsininhibitor，KTi)和Bowman—birk型蛋白酶酶抑制剂是大豆品质的主要营养抑制因子之一。生大豆抑制剂(Bowman—birktrypsininhibitor。BBi)2种，占大抗营养作用的4O％是由蛋白酶抑制因子引起的。主要表豆蛋白含量的6％，其中KTi含量为

4、1．4％左右。主要表现在抑制畜禽小肠胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性，降低达形式为21．5kDa的蛋白质，对胰蛋白酶有专一的抑制其对饲料蛋白质的消化吸收，从而引起畜禽生长停滞及性；BBi含量为0．6％左右，分子量为8kDa(单子叶植物畜禽胰腺肥大和增生等。因此，创制缺失胰蛋白酶抑制或双子叶植物)或16kDa(单子叶植物)，同时对胰蛋白剂的优质大豆新种质，可有效提高大豆的营养价值和加的色泽脱至Y32．7R3．2，可以达到二级油的质量标准。(4)其他。脱色后的油样在密闭放置1d后再测色(2)色泽改善度。复合脱色之后的油样色泽Y40泽，颜色较

5、前一天又有明显改观．推测为草酸的后续反R4．1B1．2(133．4mm)至草酸脱色之后的色泽Y32．7应所致，第3d时再次测定颜色不在有改变。推测后续反R3．2，改善比较明显。说明草酸的螯合油中铁离子、分应结束。解谷维素钠盐及强还原作用对降低高酸值稻米油的色泽参考文献从理论支撑到实际应用均具有较强的可操作性。(3)因子影响度。草酸脱色工艺中，4个因子影响[1]张克信．草酸在精炼糠油中作脱色剂[J]．中国油脂，1982(3)[2]齐玉堂．深色油脂脱色工艺研究[J]．粮食与油脂，2004(7)脱色效果的程度由高到低分别是：草酸加入形式

6、、脱色28-29．温度、脱色时间和草酸加入量。此结果表明：草酸以固[3]董建林，魏冰．高酸值油脂助脱色与酯化脱酸工艺的研究[J]体形式加入好，可摒弃液体加入法：温度85～100~C为中国油脂，2000，25(6)：82—83．好，温度过高会引起氧化反应而使油色回色；脱色的时间15min已经足够，长时间的反应同样会因氧化反应的基金项目：辽宁省教育厅高等学校科学技术计划项目(L2010621)加深油色：影响度最小的是草酸用量．试验表明：0．1％收稿日期：2012—03—12的草酸量在脱色冷却后可观察少量草酸析出，说明0．1％作者简介：

7、肇立春(1966一)，女，辽宁丹东人，硕士，教授，研究方的草酸已经微过量．0．05％的草酸量没有析出现象且油向油脂加工及粮油副产品的综合利用。通信地址：(110034)沈阳市黄河北大街253号色改善效果略欠佳。74f蕊豳·2012．08油脂工程·Technique技术工品质。以往在大豆的品质改良及抗营养抑制因子的研1．2方法究中．多采用常规的杂交和回交等方法，但由于受到遗1．2．1KTi基因完整ihpRNA构件的克隆传基础窄育种时间长的限制，改良作用有限。利用质粒小量抽提试剂盒提取KTi基因ihpRNA种子RNA干扰是指一些小的双

8、链RNA(double—stranded特异性表达载体p7otP—GUS—KTiS的质粒DNA，以其为模RNA，dsRNA)高效、特异地阻断体内相应基因的表达，板，采用种子特异性启动子7仅P的上游引物PBS和NOS促使mRNA降解，使细胞表现出特定