对山东地区ttv基因片段的检测及其部分核酸序列测定论文

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1、对山东地区TTV基因片段的检测及其部分核酸序列测定论文.freelittedvirus;nonA-Ehepatitis;NucleotidesequenceAbstract:AIMToinvestigatetheprevalenceofTTVinfec-tionandgeicvariationofTTVisolateinShandongProvince.METHODSTTVDNAplifiedandde-tectedbyRT-PCRmethodsfromseraofpatientsa（n=12）.Thepos

2、itivePCRproducts（TTVSD4，TTVSD5）ologya.Oneofthem（TTVSD6）ologyapatientsinShandongprovince.ThesecquenceresultsshoologyL，分离血清，分装后置-80℃冰柜保存备用，采血同时进行流行病学调查.1.2方法1.2.1TTVDNA提取取血清100μL加300μL裂解液［13.3mmolL-1Tris-HCL，pH8.0，6.7mmolL-1乙二胺四乙酸（EDTA），6.7gL-1十二烷基硫酸钠（SDS），13

3、3mgL-1蛋白酶K］.70℃水浴1h，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于20μL1×TE中.1.2.2PCR扩增参照TTV日本株序列设计2套引物，由上海生工生物工程有限公司合成.分别为:S1:5’-CCATTCACAGACAGAGGAGAAGGC-3’，S2:5’-CTAATAAGAAGTCCCTTTACAGACCC-3’，AS1:5’-GGAGTGGGTTTCGGGGCAGGG-3’，其中，S1/AS1为外引物，S2/AS1为内引物，预期扩增片段为323bp;S3:5’-CAATAGAGTCCCTAGAA-

4、GCTTACA-3’，AS3:5’-GGTAACAAG-GTAGGGTTGATATC-3’，S4:5’-GGAACTCA-CATTCCATACCTG-3’，AS4:5’-GTTTGACTC-CCAGGATTCG-3’，其中S3/AS3为外引物，S4/AS4为内引物，预期扩增片段为329bp.PCR试剂购自Progema公司.PCR扩增条件:取模板5μL，10×Taq缓冲液5μL，dNTP0.1mmolL-1和Taq酶1U，引物浓度均为0.3μmolL-1，共50μL反应体积;取第1次PCR产物5μL作模板，其

5、他同第1轮.循环条件均为:94℃预变性180s，94℃35s，56℃35s，72℃45s，扩增30个循环，72℃延伸8min.取第2次PCR产物15μL20gL-1琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果.1.2.3序列测定和分析PCR产物纯化后用PE公司的ABIPrism377DNA自动测序仪行PCR产物直接测序，测序引物为S4/AS4，将所测序列通过In-terBlast进行同源性分析.2结果26例非甲～庚肝炎和12例肝细胞癌患者血清中TTVDNA阳性检出率分别为24%（11/26）和25%（3/12）.对P

6、CR阳性产物直接测序，InterBlast检索结果表明山东TTVSD4、TTVSD5和TTVSD6与日本TTV原型（基因1a）TA278（AB008394）［1］相应部位核苷酸序列同源性分别为99%、100%和99%，此3株间核苷酸同源性也达99%以上（Fig1）.图1略3讨论1997年，NishizaotoH，NishizaiM.MolecularCloninandcharacteri-zationofnovelDNAvirus（TTV）associatedotoH，KonishiK，YoshizaiM.A

7、novelDNAvints（TTV）associatedinaselevelsinposttransfusionhepatitisofunknoBiophysResmun，1997;241（1）:92-97.［3］ZhouYS，HeZP，DongQF，ilMedSci），1998;22（2）:81-83.［4］YuJG，HanJJ，XiaoDM，ShangQH，ZhouXM，ZhangGS.EpidemiologyofTTVinfectionandpartialDNAsequenceanaly-sisofTT

8、VIsolatesinShandong［J］.MeiguoZhonghuaYixueZazhi（JAmChinMedAssoc），1999;5（5）:16-17.［5］LinnenJ，Jrissibleagent［J］.Science，1996;271（5248）:505-508.［6］YuJG，HouXR，Pan.PCRdetectionofhepatitisGvirusRNAinseraandl