两种凝血酶原提取方法的比较

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1、两种凝血酶原提取方法的比较作者：赖翼吴民泸代娟陈曼段佳慧刘阳【摘要】目的比较等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原的纯度。方法分别采用等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原，凝血酶原经单独钙离子激活得到凝血酶，通过凝血酶效价测定、蛋白质浓度测定，计算出凝血酶的比活性。结果采用等电点沉淀法提取的凝血酶原经激活后得到的凝血酶比活性为11.01±1.54U/mg，采用柠檬酸钡吸附法提取的凝血酶原经激活后得到的凝血酶比活性为130.17±12.30U/mg，经配对T检验，P＜0.01.结论与等电点沉淀法相比，采用柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取得到的凝血酶原纯度更

2、高。【关键词】凝血酶原；凝血酶；等电点沉淀法；柠檬酸钡吸附法【Abstract】ObjectiveToparethepurityofprothrombinpurifiedbymethodofprecipitatingatisoelectricpointandadsorptionmethodcitratefrombloodplasmaofpig.MethodsProthrombinethodofprecipitatingatisoelectricpointandadsorptionmethodcitratefrombloodplasmaofpigandactivatedbyCa

3、2+onlytothrombin.ThenthetiterofthrombinandtheconcentrationofprotEineasuredtogetthespecificactivityofthrombin.ResultsThespecificactivityofthrombinactivatedbyCa2+fromprothrombinpurifiedbymethodofprecipitatingatisoelectricpointg.ThespecificactivityofthrombinactivatedbyCa2+fromprothrombinpurifi

4、edbyadsorptionmethodcitrateg.Thespecificactivitiesbinpurifiedbyadsorptionmethodcitrateishigherthanpurifiedbymethodofprecipitatingatisoelectricpoint.【Keybin；thrombin；methodofprecipitatingatisoelectricpoint；adsorptionmethodcitrate凝血酶是参与机体凝血过程的一个重要的凝血因子，在体内以凝血酶原形式存在［1］。20世纪中期开始人们将凝血酶应用于临床，由于其疗

5、效显著，应用也越来越广泛。之后美英日等国从牛血浆中分离出凝血酶应用于临床，并证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和局部外用时无过敏反应和其他不良反应等，因而目前所使用的凝血酶制剂大多来源于动物血浆，国内采用猪血浆制备凝血酶的报道较多［2］。等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法是两种主要的凝血酶原提取方法［3］，凝血酶原经单独的钙离子激活可得到凝血酶。目前，国内尚无研究比较应用等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法所得到的凝血酶原纯度的差异，哪种方法得到的凝血酶原纯度更高？更适合用于提取凝血酶原?本文对这两种方法从猪血浆中提取凝血酶原的纯度进行了比较。为相关实验中选择合适的凝血酶原

6、提取方法提供参考。1材料与方法1.1材料柠檬酸钠抗凝的新鲜猪血浆。1.2主要试剂纤维蛋白原和凝血酶标准品购自美国SIGMA公司，Bradford蛋白质定量检测试剂盒购自美国BioRad。其余试剂均为国产分析纯。柠檬酸钡吸附法使用的四种溶液分别为，溶液A：1.0mol/LBaCl2溶液；溶液B：0.02mol/LTris，0.15mol/LBaCl2，0.10mol/LNaCl，pH7.4；溶液C：0.02mol/LTris，0.10mol/LNaCl，0.20mol/LNa2EDTA，pH7.4；溶液D：0.02mol/LTris，0.15mol/LNaCl，pH6.5.1

7、.3主要仪器GEGeneQuant1300核酸蛋白分析仪。1.4方法1.4.1凝血酶原提取将收集到的5份猪血浆按1～5编号，各均分为2份，其中1份采用等电点沉淀法提取凝血酶原，另1份采用柠檬酸钡吸附法提取凝血酶原。1.4.1.1等电点沉淀法猪血浆用蒸馏水稀释10倍，用5%冰乙酸将其pH调至5.3，4℃静置过夜，3000r/min离心15min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，过滤备用。1.4.1.2柠檬酸钡吸附法猪血浆中加入溶液A，体积比为10∶1，4℃搅拌30min，静置30min后，3000r/min离