《聚合酶链反应》word版

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1、PCR引物的优化设计聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)通过多循环的变性、退火和延伸过程，能够在时间内获得大量目的DNA片段，称为一种无细胞分子克隆技术，已经成为短生命科学实验室获取目的DNA片段的常规方法。聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是用于在体外酶促扩增特定DNA片段的快速方法。像分子克隆技术一样，PCR方法使得许多以前不可能的实验得以完成，PCR的应用似乎是无止境的，并正在不断地扩展，其中包括从基因组DNA和cDNA直接克隆目的基因，体外诱变和DNA工程，对法医样品进行

2、的遗传指纹鉴定，传染病原的分析，遗传疾病的产前诊断，基因的等位序列变异分析，RNA转录物结构的分析，基因组足迹分析以及对基因组DNA和cDNA进行直接核苷酸序列测定。同时相关的技术也突飞猛进地发展。PCR方法的广泛应用及其相关的技术的顺利进行均离不开PCR引物的合理设计。可以说，PCR引物的合理设计是任何PCR反应能否进行及其产物的特异性、产率高低的关键。目前许多计算机软件可用于引物的设计，但由于各种计算机软件自身存在的局限性，其设计的引物并无法满足实验者不同需要。目前最常用的是计算机辅助设计，即实验者根据PCR引物设计的原则并结合自己的经验人工设

3、计引物，然后选择合适的软件分析引物的合理性。引物设计原则：2．1原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核昔酸片段，其中在扩增的DNA片断5’端的引物对应于有意链DNA序列，3’端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。若这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结

4、构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generunr分析）。4.正向引物的设计4.1酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。A：扩增的DNA用于表达时：(1)自身有启动子。如果要利用自身的启动子，扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面

5、。可在所扩增的DNA序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切位点进行扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。(2)扩增片段里自身无启动子。对于自身无启动子而又用于表达的基因序列，必须将其接于外源启动子的后面才能顺利表达。在翻译过程中，mRNA必须首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码子AUG，另外一个是起始密码子AUG上游3bp-11bp处的3bp-9bp的序列，后者由ShineJ及DalgarnoL发现，故称为SD序列。SD序列富含嘌呤核苷酸，而16SrRNA3’

6、端富含嘧啶核苷酸，二者刚好互补，可促进mRNA核糖体结合，提高翻译效率。因此，在基因重组过程中应将结构基因接于SD序列之后，以便为mRNA提供核糖体结合位点，提高基因表达效率。起始密码子与SD序列之间核苷酸数量变化过大会影响翻译效率，所以应该将目的基因的起始密码子与启动子的ATG相重叠，这样才能保证起始密码子与SD序列之间核苷酸数量不改变，不影响翻译效率。一般的启动子3’断酶切位点是NcoI（CCATGG）或NdeI(CATATG)，若添加的酶切位点为NdeI，引物的5’端酶切位点设计为NdeI即可；若添加的酶切位点为NcoI时,应该根据目的基因起

7、始密码子后的碱基种类的不同选择不同的酶切位点：如果该碱基是G，则可以直接设计为NcoI位点；如果该碱基不是G（如扩增的目的基因为5’-aagtcgtatgactaccgttcccgatctcga-3’）因为NcoI位点ATG后的G与DNA起始密码子后的a不配对，所以在设计引物的酶切位点时不能象上例简单地设计为NcoI。在处理这个问题上有三种方法：一种是直接设计为NcoI位点,其缺点是改变了阅读框的第一个氨基酸，可能对表达会有影响；为了保证原始的阅读框，可采取以下两种方法：第二种方法是利用同尾酶连接法，即在保证起始密码子及其后的碱基不改变的情况下选择

8、合适的酶切位点。如上例将引物的酶切位点设计为tcatga（BspHI的酶切位点）,这样既保证了阅读框的atga碱基，又因为