《聚合酶链反应pcr》ppt课件

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1、第三节聚合酶链式反应PolymerasechainreactionPCRContentofTable１定义２技术优点３原理４标准反应体系５反应五要素６热循环条件的选择７反应特点８常见问题与对策９污染10应用1定义在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。Home2技术优点特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等Home3原理RegiontobecopieddenaturatationPrimerannealingPrimerextensionCycle2Cycle3PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖

2、于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。PCRproductPCR反应曲线Home4标准反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物各200μmol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5u（Mg2+）1.

3、5mmol/L加双或三蒸水至100ulHome5反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）5.1引物引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度引物设计的原则①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右②引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,ATGC最好随机分布④避免引物内或引物间出现二级结构避免两引物间互补，特别是3`端⑤

4、引物3`端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基⑥引物中可以加上合适的酶切位点要作酶切时加⑦引物的特异性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑧两引物的Tm值接近5.2酶及其浓度TaqDNA聚合酶注：无3`→5`方向的校正活性[DNA复制1/109；PCR出错率1/(2×104)]一个典型的PCR反应约需酶量2.5U浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少5.3dNTP的质量与浓度dNTP使用注意：1)保存：使用时应配成高浓度，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解；2)使用量：在PCR反应中，dNTP应为20-200u

5、mol/L。3)成分配比：注意4种dNTP的浓度要相等；5.4模板（template）模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一。5.5Mg2+浓度1)Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响:Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会降低TaqDNA聚合酶活性，使反应产物减少。2)在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜；Home6热循环条件的选择PCR反应条件:温度时间循环次数6.1温度与时间的设置●设置变性-退火-延伸三个温度点：标准反应中采用三温度点法：1）93-95℃变性；2）

6、40-60℃退火；3）70-75℃延伸●对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性♠若低于93℃则需延长时间♠但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影响。②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的长度复性温度当引物长度为15-20个碱基时，在高离子强度中反应（如1MNaCl）Tm=4（G+C）＋2（A+T）

7、复性温度=Tm值-（5～10℃）复性时间一般30～60sec，足以使引物与模板间完全结合③延伸温度与时间：温度：一般70～75℃，常用温度为72℃。时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min。6.2循环次数●决定PCR扩增程度●主要取决于模板DNA的浓度●选在25～40次之间Home7反应特点7.1特异性强靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。7.2灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加从100万个细胞中检出一个靶细胞在细菌学中最小检出率为3个细菌7.3简便、快速在DNA扩增仪中进行

8、变性-退火-延伸反应，一般1～3小时完成。7.4对模