聚合酶链反应.doc

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1、核酸扩增　　聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)由美国Centus公司的KaryMullis发明，于1985年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检疫中用于微量样品的检测。1.PCR的基本原理和过程　PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA做为模板，以和模板正

2、链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合(退火)、引物延伸合成DNA这三步构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板DNA。这样，目的的DNA的数量将以2n-2n的形式累积，在2小时内可扩增30(n)个循环，DNA量达原来的上百万倍。PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交

3、链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物和Mg2+存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链的延伸反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。2.PCR反应条件和反应系统的组成(1)反应条件　PCR反应通过三种温度的交替循环来进行，一般94℃变性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，依此条件进行30次左右的循环。(2)PCR反应系统的组成　标准的PCR反应体系一般选用5

4、0-100μl体积，其中含有：50mmol/LKCl，10mmol/LTris.HCl(室温，pH8.3)，1.5mmol/LMgCl2明胶或牛血清白蛋白(BSA)，2种引物，各0.25(mol/L，4种脱氧核糖核苷酸底物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)各200(mol/L，模板DNA0.1(g，TaqDNA聚合酶2.5iu。3.PCR基本操作　一个典型的PCR反应可按以下步骤进行:(1)将下列成分依序加入0.5ml灭菌离心管中并混匀:灭菌双蒸水30μl10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物，每种浓度为1.25mmol/L

5、16μl引物15μl(100pmol)引物25μl(100pmol)模板DNA2μl加灭菌双蒸水至终体积100μl(2)置94℃加热5分钟；(3)将0.5μlTaqDNA聚合酶(5iu/μl)加入反应混合液中；(4)将100μl轻矿物油加入混合液表面，以防水分蒸发；(5)按所设定的反应条件进行循环反应（在PCR仪上进行）；(6)反应终止后，取样品进行凝胶电泳，Southern杂交或DNA序列分析以鉴定是否得到特异的扩增产物。4.PCR衍生技术　PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR以扩增cDNA。经不断

6、发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR外，尚有不对称PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫PCR和套式PCR等。(1)反转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT－PCR)　RT－PCR用于扩增RNA样品。在PCR体系中先引入反转录酶，将RNA反转录获得cDNA，再以cDNA做为PCR的模板，加入引物和TaqDNA聚合酶按正常PCR方式扩增cDNA。这一技术广泛应用于RNA和RNA病毒的检测。(2)锚定PCR(AnchoredPCR)　通常进行的PCR试验必须知道欲扩增DNA或

7、RNA片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行PCR。当欲扩增的片段序列未知时，可通过锚定PCR进行扩增。其基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA3’端加上同源多聚物poly(dG)尾，通过与其互补的锚定引物poly(dC)来保证扩增反应的特异性。(3)反向PCR(InversePCR)　常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段，反向PCR则用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段环化，再用限制性内切酶切开已知序列，这样线性化后原位于已知序列

8、两侧的未知序列变为位于已知序列之间，再经常规PCR操作就可大量扩增未知序列。(4)不对称PCR(AsymmetricPCR)　不对称PCR又称单链扩增PCR。一般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PC