小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良论文

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1、小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良论文【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。吴建芳（1972～），女，汉族.freelpleandeffectiveprimaryculturemethodsformousevascularsmoothmusclecells(VSMC).MethodsReformedenzymat

2、icdigestion.ResultsVSMCorethan98%eetvariouscelltests.Conclusionparingethods,thisapproachescansavemuchtimeandmorematerials,alsohavebettercellquantitiesandpurity.Keyarycult在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所

3、提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。1材料与试剂1．1组织C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。1．2试剂：鼠抗SMC-α-actin,Cy2conjugatedaffinitypurifiedant

4、i-mouseIgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。1．3培养基：在DMEM培养基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。1．4酶消化液：CollagenaseTypeⅡ7mg溶于5mlDMEM培养基中(无血清)，过滤除菌即用。1．5７０％乙醇：用无菌蒸馏水配制。1．6器械、仪器：齿、平镊，组织、眼科剪，无菌注射器，培养皿，解剖显微镜（Paxcam,Vistavision），荧光显微镜(LEICADMI6000B）。2方法2．1常规麻醉小鼠，70％乙醇冲洗颈部和腹部,打开胸、腹腔

5、,暴露心脏。2．2５mL注射器穿刺左心室，PBS缓冲液冲洗主动脉。2．3完整分离主动脉，放入100mm无菌平皿，滴1～2滴PBS缓冲液。2．4解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明（如粗糙不平说明外膜去除不干净）。2．5取出血管，放入另一有PBS缓冲液的平皿里，转到超净工作台操作。2．6眼科剪将血管快速剪成１～２mm2大小后用胶原酶消化３～４h（组织块变成细胞团即可）。2．7加入DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入1ml新鲜培养基重悬细胞，接种于１２孔培养板中的一孔，常规静置培养。2．8第2天观察是否有细菌污

6、染，如有要更换新鲜培养液，静置培养。于第５、６天细胞生长达培养皿面积的８０％左右时可传代，常规方法即可。3细胞鉴定免疫荧光法鉴定平滑肌细胞：常规消化，细胞接种于培养载玻片。第2天用PBS缓冲液轻缓洗涤，加3.7％福尔马林液在室温下固定30min后用PBS缓冲液洗涤３次，２min／次。然后用0.1％Triton-x-100(PBS配制)室温下渗透细胞10min，以便抗体更好的进入细胞。用10％山羊血清(PBS配制)封闭非特异性抗原30min，鼠抗SMC-α-actin（1:200PBS稀释）室温下孵育细胞２h，PBS缓冲液洗涤

7、３次，５min／次。以下步骤避光：用荧光标记二抗（1:200PBS稀释）在室温下孵育细胞１h，PBS缓冲液洗涤３次，５min／次，然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测（440/510nm,Ex/Em）。4结果细胞于第2天游离出，第3天沿细胞团成放射状生长，成梭形，传代后细胞生长较快，成典型的峰谷样生长，细胞形态多呈宽大的长梭形，核大一只小鼠的主动脉用该法培养，１０天左右即可获得１０6个细胞，传代生长快，可满足任何细胞试验要求。流式细胞仪检测细胞纯度达98%以上，免疫荧光检测显示细胞SMC-α-actin染色呈阳性，绿色荧

8、光呈束状，显示肌丝特征。5讨论传统的原代培养方法［１,２］有两种，一种是酶消化法，将组织用合适的酶消化后培养，因除去了妨碍细胞生长的间质，所以产量高，但因步骤繁琐，易发生污染且材料消耗较多，只适合培养大块组织。另一种是组织块培养法，将组织活体取出后剪切成小块，贴于瓶壁等待细胞从组织四周游离