小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良解读.doc

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1、小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良        [08-10-3013:48:00]    作者：吴建芳    编辑：studa20【摘要】 目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士【关键词】 小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养   Abstract Objec

2、tive Tocreateasimpleandeffectiveprimaryculturemethodsformousevascularsmoothmusclecells(VSMC). Methods  Reformedenzymaticdigestion.ResultsVSMCwasgrownwellandfast,thepurityismorethan98%whichcanmeetvariouscelltests.Conclusion Comparingwithtraditionalmethods,this

3、approachescansavemuchtimeandmorematerials,alsohavebettercellquantitiesandpurity.   Keywords  Mouse AortaVSMC Primarycult   在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进

4、程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。   1 材料与试剂   1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。   1．2 试剂：鼠抗SMC-α-actin,Cy2conjugatedaffinitypurifiedanti-mouse   IgG［H/L］，戊

5、巴比妥钠注射液。   1．3 培养基：在DMEM培养基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。   1．4 酶消化液：CollagenaseTypeⅡ7mg溶于5mlDMEM培养基中(无血清)，过滤除菌即用。   1．5 ７０％乙醇：用无菌蒸馏水配制。   1．6  器械、仪器：齿、平镊，组织、眼科剪，无菌注射器，培养皿，解剖显微镜（Paxcam,Vistavision），荧光显微镜(LEICADMI6000B）。   2 方法   2．1 常规麻醉小鼠，70％乙醇

6、冲洗颈部和腹部,打开胸、腹腔,暴露心脏。   2．2 ５mL注射器穿刺左心室，PBS缓冲液冲洗主动脉。   2．3 完整分离主动脉，放入100mm无菌平皿，滴1～2滴PBS缓冲液。   2．4 解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明（如粗糙不平说明外膜去除不干净）。   2．5 取出血管，放入另一有PBS缓冲液的平皿里，转到超净工作台操作。   2．6 眼科剪将血管快速剪成１～２mm2 大小后用胶原酶消化３～４h（组织块变成细胞团即可）。   2．7 加入DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入1ml

7、新鲜培养基重悬细胞，接种于１２孔培养板中的一孔，常规静置培养。   2．8 第2天观察是否有细菌污染，如有要更换新鲜培养液，静置培养。于第５、６天细胞生长达培养皿面积的８０％左右时可传代，常规方法即可。