重组天花粉蛋白研究进展

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1、重组天花粉蛋白研究进展【摘要】　　目的天然天花粉蛋白(TCS)是一种拥有抗肿瘤、抗病毒的核糖体失活蛋白，但在临床应用时有细胞毒性强和诱导严重过敏反应等不良反应。利用基因工程技术和化学修饰的方法对天然TCS进行改造和修饰，以期获得高效、低毒和低免疫原性的TCS供临床和研究使用，是当前研究的热点课题，文章综述了该领域的新近研究进展。【关键词】天花粉蛋白；定点突变；化学修饰；抗原性　　传统中草药天花粉，入药已有两千年历史，中医用于中期妊娠引产及宫外孕、葡萄胎、腹腔妊娠等疾病的治疗。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是天花粉发

2、挥药效的主要成分，Choovich叶片的基因组中分离到全长的TCS基因。序列分析结果显示，该基因没有内含子结构，成熟TCS由247个氨基酸组成，前体蛋白还包括一段信号肽(23个残基)和一段C末端肽序列(19个残基)［2］。近年来的临床研究发现，TCS对呼吸、消化、血液、生殖等多个系统的恶性肿瘤细胞均具有显著的生长抑制并诱导凋亡的作用［3～5］，表现出广泛的抗病毒、抗肿瘤效应［6～8］。但由于TCS具有很强的免疫原性，可诱导产生破坏性抗体IgG和IgE［9］，在临床试验中会也产生一些如过敏反应、神经和肾脏毒性等副作用［10，11］，从

3、而限制了临床应用。　　随着分子克隆技术的发展，很多研究者致力于改变TCS结构，以达到降低免疫原性，提高药效，延长其体内代谢时间等为目的研究［2］。本文总结了近年来重组TCS及其生物学活性方面的相关研究进展。　　1含有定点突变的重组TCS　　TCS是一种I型核糖体失活蛋白，具有N-糖苷酶活性，它能使28srRNA第4324位点上的A脱腺嘌呤，由此导致核糖体失活并抑制蛋白质的生物合成。WongKB等对TCS的酶活性中心处的Glu160和Glu189进行定点突变，并对突变后的重组TCS进行效价分析（体外蛋白合成抑制实验），结果发现，Glu

4、160和Glu189上的羧基参与催化反应并对中间过渡复合体起到稳定作用。与野生型TCS相比，E160A（Glu-Ala突变）和E160D（Glu-Asp突变）分别使TCS的蛋白合成抑制效应减低15倍和52倍。E160A突变时，Glu189上的羧基可以替代Glu160的羧基发挥作用，但E160D突变时，Asp上的羧基偏离最佳催化位点,而Glu189上的羧基又无法补偿，因而后者能更大程度地影响TCS的活性。为证实活性位点处的羧基在介导酶催化活性中重要性，Wong等对Glu160和Glu189进行E160A/E189A双突变，结果TCS对

5、蛋白合成的抑制效应下降了1800倍。与天然TCS相比，E160D、E160A突变蛋白的抗增殖、免疫抑制能力也都显著降低，这些结果得到NgTB等实验的进一步证实，并发现重组TCS对体外培养胚胎细胞的毒性较其他细胞（脾细胞和肿瘤细胞）要高。　　随后徐琼芳等利用DNA聚合酶链式反应(PCR)技术，将天然天花粉蛋白（nTCS）基因中22位精氨酸(Arg)定点突变为亮氨酸(leu)，突变后的天花粉蛋白R22LTCS其核糖体抑制功能降低了10%。从TCS的晶体结构分析，TCS中Arg22与Ala161和Ala162之间形成两个H键，Arg22突

6、变为Leu22后，上述氢键将消失，由此影响临近的酶活性位点（Glu160-Arg163）的构象。姚宏兵则将TCS基因的两个保守残基14位酪氨酸（Tyr）和22位精氨酸（Arg）同时定点突变为苯丙氨酸（Phe）和亮氨酸(leu),得到的重组蛋白Y14F/R22LTCS对核糖体活性的抑制能力比天然TCS降低了7.5倍,活性变化不显著,说明TCS的Try14和Arg22对维持其活性部位构象并不是必需的。但由于Y14F/R22LTCS在大肠杆菌E.coli中的表达量与天然TCS相比明显下降,因此,Tyr14和Arg22可能与TCS翻译后的折

7、叠有关。　　ChanSH［12］等认为，成熟TCS的C末端可能与该蛋白的抗原性有关，他们通过系列删除的方法逐步去掉成熟TCSC末端的氨基酸残基，结果发现C末端系列对维持TCS的正常构象极为重要，为保持TCS的基本生物活性，C末端能够被删除的氨基酸数最多只能是7个。这种C末端移除7个氨基酸的突变TCS（C7-TCS）其体内抗原活性降低2.7倍、细胞毒性则下降10倍。他们对C7-TCS的结构进行分析发现，与野生型TCS相比，突变导致蛋白螺旋程度降低，色氨酸192（Trp192）暴露和热稳定性下降。这些构象上的改变是否是其免疫原性下降的分

8、子基础有待进一步深入探讨。　　近来，王萍等［13］通过RT-PCR技术扩增无N端信号肽和C端肽序列的TCS基因，成功构建了原核高效表达质粒pET-29b-TCS并获得重组蛋白。他们发现与TCS前体蛋白相比，重组蛋白的抗原性显著降低。聂