伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征论文

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1、伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征论文袁德保杨晓泉黄科礼【摘要】研究了色谱方法对伴大豆球蛋白组成3个亚基的分离纯化工艺条件，并利用圆二色光谱对纯化得到的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。结果显示：利用离子交换色谱（DEAEsepharosefastflomobilizedmetalaffinitycolumn，IMAC）相结合的方法，能将3个亚基组分完全分开，得到了能制备相对大量的3个亚基α′,α和β的稳定工艺，纯度为95%，回收率达75%。远紫外CD结果显示.freelatographicmethodandthent

2、hesecondaryandtertiarystructuresofthreeconstituentsubunitsinoethyl(DEAE)SepharoseFastFlonandimmobilizedmetalaffinitycolumn(IMAC)succeededinisolatingthesesubunitspletely,givinghighpurity(95%)andatotalrecoveryratioof75%.ThedatafromfarUVCDshoa等［７］利用基因工程的方法，得到了未进行后期糖基化修饰

3、的亚基以及不具有扩展区的亚基（αc和α′c）。Lovati等3利用制备型双向电泳得到了单一的β亚基和α′,α的混合物。Maruyama等8,9从大豆缺失体中分离得到了3种亚基组分。Duranti等10建立了从传统大豆品种中较大规模制备α′的方法。此外，从传统大豆品种中制备3个亚基的方法也有报道11,12。但仍需建立一种能制备高纯度且较大制备量的分离制备方法13,14。而上述提到的几种制备方法在一般实验室难以操作(如制备型双向电泳、大豆缺失体品种)，且制备量小。本研究建立了能普遍适用的制备(具有一定制备量)高纯度伴大豆球蛋白的制备方法

4、，并对制得的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。2实验部分2.1仪器与试剂UVP凝胶成像系统；AKTA蛋白质纯化仪（美国GE公司）；PYCZ30垂直板电泳仪（北京六一仪器厂）；MOS450园二色谱仪(法国BioLogic公司)。低变性脱脂大豆片（白豆片，山东新嘉华有限公司提供）。白豆片粉碎后，过０．１８mm孔径筛并储存于4℃下密闭容器中。豆粉蛋白质含量为（55.5±0.4）％，氮溶指数84.0％。树脂（DEAEsepharosefastflomobilizedmetalaffinitycolumn）和柱子（4.5cm×3

5、0cm,美国GE公司）。试剂为分析纯或更高级别。2.2实验方法2.2.1伴大豆球蛋白的制备采用Nagano法15制备伴大豆球蛋白，电泳鉴定纯度后，透析、冻干后4℃保存以备用。2.2.2亚基组分的分离纯化5g伴大豆球蛋白溶解在60mL含6mol/L尿素的TrisHCl缓冲液（简称为标准缓冲液,pH7.0）中，先用标准缓冲液将离子交换柱平衡。上样后,.freelol/LNaCl），其中第二个峰为纯度很高的α′和α的混合物。将第二个洗脱峰透析、冻干，以便进行进一步的IMAC分离。将α′和α的混合物（5g）溶于60mL0.05mol/LT

6、risHCl缓冲液（pH7.0,含0.5mol/LNaCl和6mol/L尿素）。先将吸附了Ni2+的IMAC柱子用0.05mol/LTrisHCl缓冲液（pH7.0,含0.5mol/LNaCl和6mol/L尿素）平衡好，然后上样。用上述缓冲液将柱子上未被吸附的部分洗脱下来，用含有0.1mol/L咪唑的上述缓冲液可以将α′洗脱下来。将各部分洗脱液收集，透析、冻干以备用。2.2.3十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)SDSPAGE电泳按照Laemmli法16进行。２．２．４远紫外和近紫外圆二色谱分析采用园二色谱仪

7、器进行CD测定。远紫外圆二色光谱测定样品浓度为0.1g/L,近紫外圆二色谱测定样品浓度为1g/L。样品溶解在5mmol/LTrisHCl缓冲液中。扫描次数为2次。二级结构计算软件为CDPro。3结果与讨论3.1伴大豆球蛋白制备通过Nagano方法15制备得到了伴大豆球蛋白。如图1所示，伴大豆球蛋白（图1，泳道2）具有其典型的３条电泳条带，分别对应的是3个亚基α′,α和β（分子量分别为75,71和51kDa）。通过光密度扫描技术，计算得到3个亚基条带的光密度之和占总个泳道的光密度比值的95%，即制备得到的伴大豆球蛋白的纯度约为95%

8、。3.2伴大豆球蛋白组成亚基的色谱分离和制备利用离子交换色谱对制备得到的伴大豆球蛋白，进行了第一阶段的纯化。纯化后得到两个穿透峰(峰1和峰2)，然后进行线性洗脱（0～0.5mol/LNaCl），洗脱得到峰3、峰4和峰5。各个洗脱峰的电