伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第6期2010年6月ChineseJournalofAnalyticalChemistu877～880DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．00877伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征袁德保杨晓泉黄科礼(华南理工大学轻工与食品学院，广州510640)摘要研究了色谱方法对伴大豆球蛋白组成3个亚基的分离纯化工艺条件，并利用圆二色光谱对纯化得到的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。结果显示：利用离子交换色谱(DEAE—seph

2、arosefastflow，DEAE为二乙氨乙基)和金属螯合层析(Immobilizedmetalaffinitycolumn，IMAC)相结合的方法，能将3个亚基组分完全分开，得到了能制备相对大量的3个亚基OL，和的稳定工艺，纯度为95％，回收率达75％。远紫外CD结果显示，在3个亚基的二级结构中，螺旋较少，但都具有较高含量的口折叠和无规卷曲；近紫外CD结果显示，3个亚基在制备过程中因为尿素的变性作用，都已经散失了三级结构。关键词伴大豆球蛋白；亚基；纯化；结构1引言伴大豆球蛋白是大豆的两种主要

3、贮藏蛋白之一，占大豆贮藏蛋白含量的30％’。伴大豆球蛋白通常以由3个亚基Ot，和JB通过非共价键形成的三聚体形式存在。大豆贮藏蛋白因其良好的营养及功能特性，使其在食品领域中广泛应用。目前，伴大豆球蛋白的亚基水平的研究是一个热点，因为这类研究能解释伴大豆球蛋白在保健功效和食品应用方面的机制。Maruyama等利用基因工程的方法，得到了未进行后期糖基化修饰的亚基以及不具有扩展区的亚基(和)。Lovati等利用制备型双向电泳得到了单一的亚基和，的混合物。Maruyama等从大豆缺失体中分离得到了3种亚

4、基组分。Duranti等建立了从传统大豆品种中较大规模制备的方法。此外，从传统大豆品种中制备3个亚基的方法也有报道。但仍需建立一种能制备高纯度且较大制备量的分离制备方法。而上述提到的几种制备方法在一般实验室难以操作(如制备型双向电泳、大豆缺失体品种)，且制备量小。本研究建立了能普遍适用的制备(具有一定制备量)高纯度伴大豆球蛋白的制备方法，并对制得的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。2实验部分2．1仪器与试剂UVP凝胶成像系统；AKTA蛋白质纯化仪(美国GE公司)；PYCZ一30垂直板电泳仪

5、(北京六一仪器厂)；MOS-450园二色谱仪(法国Bio—Logic公司)。低变性脱脂大豆片(白豆片，山东新嘉华有限公司提供)。白豆片粉碎后，过0．18mm孑L径筛并储存于4℃下密闭容器中。豆粉蛋白质含量为(55．5±0．4)％，氮溶指数84．0％。树脂(DEAE—sepharosefastflow和Immobilizedmetalaffinitycolumn)和柱子(4．5cm×30em，美国GE公司)。试剂为分析纯或更高级别。2．2实验方法2．2．1伴大豆球蛋白的制备采用Nagano法制备伴

6、大豆球蛋白，电泳鉴定纯度后，透析、冻干后4cC保存以备用。2．2．2亚基组分的分离纯化5g伴大豆球蛋白溶解在60mL含6mol／L尿素的Tris．HC1缓冲液(简2009．11435收稿；2010-01-27接受本文系国家自然科学基金项目(No．20776050)、广东省自然科学基金项目(No，7006508)、教育部高校博士点基金项目(No．20070561059)资助E—mail：fexqyuang@163．eom分析化学第38卷称为标准缓冲液，pH7．0)中，先用标准缓冲液将离子交换柱平衡

7、。上样后，穿透部分洗下2个穿透峰，然后进行线性梯度洗脱(0～0．5mol／LNaC1)，其中第二个峰为纯度很高的Ot和Ot的混合物。将第二个洗脱峰透析、冻干，以便进行进一步的IMAC分离。将Ot和的混合物(5g)溶于60mL0．05mol／LTris．HC1缓冲液(pH7．0，含0．5mol／LNaC1和6mol／L尿素)。先将吸附了N的IMAC柱子用0．05mol／LTris—HC1缓冲液(pH7．0，含0．5mol／LNaC1和6mol／L尿素)平衡好，然后上样。用上述缓冲液将柱子上未被吸附

8、的部分洗脱下来，用含有0．1molZL咪唑的上述缓冲液可以将洗脱下来。将各部分洗脱液收集，透析、冻干以备用。2．2．3十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)SDS—PAGE电泳按照Laemmli法叫进行。2．2．4远紫外和近紫外圆二色谱分析采用园二色谱仪器进行CD测定。远紫外圆二色光谱测定样品浓度为0．1g／L，近紫外圆二色谱测定样品浓度为1g／L。样品溶解在5mmol／LTris．HC1缓冲液中。扫描次数为2次。二级结构计算软件为CDPro。3结果与讨论3．1伴大豆球蛋白制备通