rnai抑制nek293细胞tgfβ1表达的研究论文

《rnai抑制nek293细胞tgfβ1表达的研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、RNAi抑制NEK293细胞TGFβ1表达的研究论文崔飞伦，邱镇，陆洪兵，姚震，林大春【摘要】目的：探讨针对转化生长因子β1（TGFβ1）的小干扰RNA（siRNA）对大鼠肾间质细胞系（NEK293）TGFβ1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用.方法：利用RNA干扰（RNAi）效应设计针对TGFβ1的不同siRNA，构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系.RTPCR和TT）、碘化丙啶（PI）荧光染料、TritonX100打孔剂（美国Sigma公司）；DOSPER脂质体（美国Roche公司）；荧光显微镜（德国Opton公司）；TECANsunrise型自动酶

2、联免疫检测仪，coulterEpicsXL流式细胞仪，LS6500液闪计数仪（美国Beckman公司）.1.2方法1.2.1特异性siRNA设计及载体的构建候选siRNA序列通过BLAST工具搜索,去掉与人类RNAs同源性的靶序列，最后选取3个siRNA.根据pSilencer3.1H1质粒载体使用说明，将编码siRNA的双链互补DNA片段插入该载体的BamHI/HindⅢ位点之间以制备发夹cDNAs［3］.表达这3种siRNA的重组质粒分别命名为psiRNA1,2,3.以BamHI和HindⅢ酶切后电泳观察酶切特异性片段的大小，并对纯化的siRNA片段进行DNA测序

3、分析.另合成一不针对任何基因的无意义片段作为对照.1.2.2细胞培养及转染HEK293细胞以含100mL/L灭活小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，50mL/LCO2，饱和湿度培养，2d换液1次.取对数生长期细胞进行实验.按lipofectamineTM2000脂质体转染法，将5μgpsiRNA(13)和无意义对照质粒转染到HEK293细胞中，6h后更换正常培养基，12h后荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效率.1.2.3RTPCR检测psiRNA1,2,3三个实验组及对照组分别收集细胞（细胞总数为1×107个）按Trizol试剂操作步骤提取总RNA，选用一步法

4、RTPCR试剂盒.具体参数及条件根据引物的Tm值和扩增片断的大小进行调整.1.2.4TT比色实验1×104HEK293细胞接种于96孔培养板,37℃，50mL/LCO2，饱和湿度培养1d.按实验要求分别在细胞中加入终浓度为200nmol/L的siRNA，中止培养4h前加入MTT，应用酶标仪进行检测.检测490nm波长处的吸光度A值,计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%.1.2.6细胞凋亡检测3mL培养液含5×105细胞培养于6孔板，用预冷的700mg/L乙醇固定，4℃过夜，PI（50mg/L）染色，分析亚二倍体峰.调整细胞密度为5×106

5、/mL，取1mL细胞悬液，1000r/min4℃离心10min，重复2次，将细胞重悬于200μL结合缓冲液，加入10μL膜连蛋白Ⅴ(AnnexinV2FITC)和5μL碘化丙锭(PI)，避光室温反应15min，加入300μL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况.1.2.7转染效率的检测试剂盒中提供带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照用以监测转染效率.按说明书转染,24h后收集细胞,PBS洗涤后固定在20g/L多聚甲醛中,流式细胞仪检测.统计学处理：以SPSS11.0软件进行分析.组间差异比较采用方差分析及LSDt检验，P0.05为差异具有统计学意义.2结果2

6、.1siRNA转染效率流式细胞分析显示，几乎所有的细胞都摄取了GFP的绿色荧光.由于siRNA分子远小于质粒分子，故转染siRNA时转染效率应大于70%（图1）.A:siRNA1组;B:siRNA2组;C:siRNA3组.图1各实验组siRNA表达载体转染×200（略）2.2TGFβ1mRNA及蛋白的表达特异性siRNA处理后24hTGFβ1mRNA表达水平明显降低，与非特异性siRNA组mRNA的表达水平相比较有显著差异（表1，图2）.特异性siRNA转染24hTGFβ1蛋白表达水平明显下调，与非特异性siRNA转染组比较差异有统计学意义，TGFβ1mRNA及蛋

7、白表达在实验组间无显著差异（表1，图3）.表1脂质体介导的siRNA表达载体转染24h后对TGFβ1表达的影响（略）aP0.05vs阴性siRNA对照和阳性siRNA对照.A：非特异性siRNA对照；B：特异性TGFbetasiRNA1；C：特异性TGFbetasiRNA2；D：特异性TGFbetasiRNA3；M：DNAmarker.图2RTPCR检测TGFβ1siRNA转染后TGFβ1mRNA表达（略）A：阴性siRNA对照；B：阳性GAPDHsiRNA对照；C：特异