补肾健脾方体外抗乙型肝炎病毒作用的血清药理学研究论文

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1、补肾健脾方体外抗乙型肝炎病毒作用的血清药理学研究论文【摘要】：【目的】采用血清药理学方法探讨补肾健脾方体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。【方法】补肾健脾方低、中、高剂量（分别为30.2、60.4、120.8g·kg-1)灌胃正常大鼠制备血清，将含药血清直接添加于体外培养的2.2.15细胞中，培养10d，观察含药血清对2.2.15细胞HBV表面抗原（HBsAg）、HBVe抗原（HBeAg）分泌的影响。【结果】补肾健脾方经体内代谢后能抑制2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌，并呈一定的量效与时效关系。低剂量组服药后3h1：4稀释度含药血清的HBeAg抑制率最高，为

2、97.91%；而中剂量组服药后3h1：2稀释度的含药血清则达到抑制HBsAg的饱和量，其抑制率为86.84%。【结论】补肾健脾方具有一定的体外抗HBV作用。【关键词】补肾健脾方/药理学肝炎病毒乙型/药物作用细胞培养血清药理学乙型肝炎病毒（HBV）感染至今仍无较理想、稳定的治疗药物，拉米夫定等核酸抑制剂虽被认为是目前治疗HBV感染最有希望的药物［1］.freelL的浓度。1.2试剂DMEM(GIBCO)培养基（华美生物工程公司），另加入新霉素(G418，由GIBCO提供)0.38g/L,HEPES(缓冲液)2.38g/L；四甲基偶氮唑盐(MTT，由SIGMA公司提供)以D

3、MEM培养基作溶剂配成0.4g/L；二甲基亚砜(广州新港化工厂)；HBeAg检测试剂盒、HBsAg检测试剂盒（ELISA法，由华美生物工程公司提供）。1.3细胞株2.2.15细胞引自广州空军医院。1.4实验动物SD大鼠20只，体质量约为250g，雌雄各半。由广州中医药大学实验动物中心提供。1.5主要仪器二氧化碳孵箱(NAPCO5410)；酶标仪(BIORAD:3550)；TILD台式冷冻离心机。1.6实验方法1.6.1细胞培养将长满2.2.15细胞的培养瓶用0.6g/L的胰蛋白酶消化2～3min，弃消化液，加少量100g/LDMEM培养液轻轻吹打，将细胞配制成3×1

4、08/L单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，其中留2孔作空白对照，其他每孔加细胞悬液0.1mL，空白孔每孔加100g/LDMEM0.1mL，37℃、体积分数5%CO2培养48h，贴壁后用于实验。1.6.2药物血清的制备［4-6］20只SD大鼠随机分成4组，分别为中药低、中、高剂量组和正常血清组。正常血清组用2只大鼠，中药低、中、高剂量组各用6只大鼠，分别按30.2、60.4、120.8g·kg-1剂量灌胃（相当于50kg成人所用剂量的5、10、20倍），每日分2次灌胃，连续3d，末次给药后1、2、3h（每个剂量的每个时间段各用2只大鼠），于无菌条件下自腹主动脉采血；正

5、常血清组大鼠灌以蒸馏水，并于最后同时采血；静置后，低温离心（10000r/min,5min）分离血清，保存于-20℃备用。1.6.3含药血清对细胞的毒性试验和抑制试验将10种不同条件的20份血清（含正常血清2份）分别按1：0、1：1的比例与20g/LDMEM维持液混和，各取100μL/孔加入1个已滴有2.2.15细胞的96孔细胞板中，即血清终浓度为1：2和1：4,每种血清每个稀释度取2孔，并设细胞对照组(不加药)4孔及空白对照组2孔。细胞对照组及空白对照组每孔均加入20g/LDMEM100μL。加入血清后培养10d，吸取培养液放入另一个96孔板中，采用酶联免疫吸附法（E

6、LISA）进行HBsAg和HBeAg测定,用酶标仪以450nm波长测定D值，求出含药血清对抗原的抑制百分率［2］：p抑制/%=（D细胞对照组-D给药组）/（D细胞对照组-D空白对照组）×100%。药物对抗原的抑制百分率：p抑制/%=（D正常血清组-D含药血清组）/（D正常血清组-D空白对照组）×100%。原96孔板中每孔加0.4g/LMTT0.1mL,37℃、体积分数5%CO2孵育4h,弃上清后加二甲基亚砜0.1mL溶解,然后以490nm波长比色测定D值，求出含药血清对细胞的破坏百分率［4］：p抑制/%=（D细胞对照组-D给药组）/（D细胞对照组-D空白对照组）×100

7、%1.7统计方法组间均数比较采用独立样本t检验（SPSS8.0forTT的D值能间接反映细胞存活情况，D值越高，细胞存活数目越多，反之亦然。从表1可看出，各组血清对2.2.15细胞无毒性作用，反而能促进其生长，且与一定的血清浓度成正比，与药物的有无关系不大，这可能与血清中含有丰富的营养成分等物质能促进体外细胞生长有关。2.2含药血清对2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的影响2.2.1正常血清组与细胞对照组比较从表1可知，正常血清组HBsAg、HBeAgD值与细胞对照组比较均有显著性差异（P＜0.01）。但正常血清组的2个浓度之间均