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1、黄芪蛰虫合剂体外抗乙型肝炎病毒的作用观察作者：党双锁，陈云茹，程延安，张正国，王宝峰，张欣，宋平【关键词】黄芪蛰虫合剂；HepG2.2.15细胞；肝炎病毒,乙型【Abstract】AIM:ToevaluatetheinhibitiveeffectsofAstragalusandThoroughfaredecoctionagainsthepatitisBvirus（HBV）invitro.METHODS:HepG2.2.15cells,astargetcells,ePCRelinkedimmunosorbentassay(ELISA)entindex(TI)&g
2、t;3.56-5.79.αIFNhadeextent.【Keyin离心，过滤除菌后备用.实验时用培养液稀释，分别配制成10,5,2.5,1.25,0.625g/L共5个浓度梯度.αIFN由深圳市海王生物工程有限公司提供，实验时分别用培养液稀释成5×105,2.5×105,1.25×105IU/L.噻唑蓝（MTT,Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO,Sigma公司）；HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒（上海华泰生物工程公司），DG5031型酶联免疫检测仪（国营华东电子管厂）；HBVDNA提取及扩增荧光检测试剂盒（广州中山大学达安基因股份有限公司），
3、PE7700型自动荧光PCR检测仪（美国PerkinElmer公司）；HepG2.2.15细胞由第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心张岩博士惠赠；DMEM、胰蛋白酶、L谷氨酰胺(Gibco公司)；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；G418(Sigma公司)；青、链霉素（华北制药厂）.1.2方法1.2.1细胞培养［3］用含200mL/L胎牛血清、400mg/LG418,1.0×105U/L青、链霉素及0.3g/LL谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞，56g/L碳酸氢钠调pH值到7.2.用2.5g/L胰蛋白酶消化传代.取对数生长期状态良好的细胞，调整细胞
4、数为1×107/L，接种于96孔板，每孔0.2mL，于37℃,50mL/LCO2培养箱培养48h，待细胞贴壁后进行试验.两种药物按配制不同浓度分组，每一浓度设3个复孔，同时设仅加细胞培养液的空白对照.每3日换同样浓度含药培养液及对照培养液1次.各孔用药第3,6,9日将吸去的上清液置于-20℃冰箱保存待检.1.2.2药物对细胞毒性试验采用MTT法.于加药第9日吸去上清液，每孔加5g/LMTT20μL,37℃培养4h，弃上清液后每孔加入150μLDMSO，震荡10min，测A490nm值.计算细胞存活率，按下列公式计算半数中毒浓度（TC50）［4］.细胞存活率（%
5、）=（实验组A490nm值/阴性对照组A490nm值）×100%.TC50=Antilog［logB+(50-B)的抑制百分率〖〗(A-B)的抑制百分率×C］.（A=＞抑制50%药物浓度，B=＜抑制50%药物浓度，C=log稀释倍数）.1.2.3HBsAg,HBeAg测定使用双抗体加心ELESA法.根据试剂盒说明测定培养上清液HBsAg,HBeAg，记录P/N值，按下列公式计算50%药物抑制浓度（IC50）.抗原抑制率（%）=（对照孔P/N值-实验孔P/N值）/（对照孔P/N值-2.1）×100%.IC50=Antilog［logB+(50-B)的抑制百分率〖
6、〗(A-B)的抑制百分率×C］（A=＞抑制50%药物浓度，B=＜抑制50%药物浓度，C=log稀释倍数）.1.2.4细胞培养上清HBVDNA检测采用Taqman荧光定量PCR法检测.按照HBV核酸扩增荧光检测试剂盒说明操作.引物序列为P1:5′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3′;P2:5′ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3′；荧光探针序列为:5′TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG3′.各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：93℃2min预变性，然后93℃45s到55℃1min循环扩增10个循环，再按93℃30s到55
7、℃45s循环扩增，共30个循环.反应结束后由计算机自动分析出HBVDNA定量结果.计算HBVDNA抑制率.HBVDNA抑制率（%）=（阴性对照组HBVDNA拷贝数-实验组HBVDNA拷贝数）/阴性对照组HBVDNA拷贝数×100%.1.2.5治疗指数的计算HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)=半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50).其中TI≥2为有效低毒；1统计学处理：数据以x±s表示，应用SPSS统计软件进行分析，组间比较采用方差分析，实验组和对照组比较采用LSDt检验.2结果2.1药物对HepG2.2.15细胞毒性测定黄芪蛰虫合剂不同浓度组
8、的细胞存活率显示，黄芪蛰虫合剂对细胞的
