白花丹参和紫花丹参生化标记分析

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1、白花丹参和紫花丹参生化标记分析【摘要】　　目的分析白花丹参和紫花丹参在蛋白水平的遗传差异。方法利用叶片过氧化物酶和种子贮藏蛋白两种生化标记对白花丹参和紫花丹参进行了分析。结果同工酶分析表明，两种丹参间过氧化物酶同工酶谱存在差异；贮藏蛋白分析表明，丹参种子蛋白主要是以盐溶性蛋白为主，水溶蛋白和醇溶蛋白较少，碱溶性蛋白更少；两种丹参种子贮藏蛋白谱带之间的差异性不明显。结论二者在蛋白水平存在一定差异。【关键词】紫花丹参；白花丹参；贮藏蛋白；同工酶；聚丙烯酰胺凝胶电泳法；生化标记　　Abstract：ObjectiveToanaly

2、zeicalmarkers(perodiaseandstorageprotEIn).MethodsTicalmakersofperodiaseandstorageproteinidegelelectrophoresis,mostofstorageproteinse;PAGE;Biochemicalmarker　　丹参Salviamiltiorrhiza味苦、性微寒，功能活血祛淤，安神宁心，排脓止痛［1］，临床应用范围较广。就其形态学性状而言，可分白花、紫花两种。传统育种中的形态学鉴定只能揭示外观差异且受环境影响较大，不能完全

3、揭示品种间的遗传差异。生化标记是以基因表达产物蛋白质作为遗传标记，主要包括贮藏蛋白、同工酶和等位酶标记［2］。生化标记分析是一种快速、简便、有效的遗传检测手段。作为生化标记的同工酶、非酶形式的蛋白质，已经被广泛地应用于遗传种质的分离、筛选、品种鉴定以及生物多样性、杂种优势的研究中［3～6］。　　本研究利用贮藏蛋白和过氧化物酶同工酶两种生化标记对白花丹参和紫花丹参进行了分析，以期了解其在蛋白质性状水平的遗传差异,为种质资源的收集和二者药效成分上的比较提供理论依据。　　　1材料与方法　　1.1材料供试材料白花丹参和紫花丹参均由山

4、东中医药大学药圃提供。　　1.2方法　　1.2.1过氧化物酶提取称取1g鲜材料，冰浴研磨，加入1ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液（pH=6.7），冰浴超声提取15min，8000r/min，0℃离心20min。上清液加入等体积40%蔗糖溶液混匀，作为供试溶液，可在4℃冰箱内储存备用。　　1.2.2蛋白质提取蛋白质提取分为分步提取和一次性提取两种。分步提取主要研究丹参种子中各类蛋白质的组成及比例；一次性提取主要比较在不同提取液的情况下，蛋白质谱带的带型。　　分步提取方法：取丹参种子粉碎后称取0.1g，加入600μl水，在60℃水浴中

5、提取40min，10000r/min离心5min，取上清液备用，再用水按同样方法冲提1次，离心弃掉上清液。然后加入600μl2.5%NaCl溶液，用同样方法提取上清液备用，再用2.5%NaCl冲提1次，离心弃掉上清液，用水冲洗1次。再加入400μl的50%异丙醇提取液，在同样条件下，提取上清液备用。最后加入400μl0.2%NaOH，同样条件，提取上清液备用。最后提取的各种蛋白质溶液，和样品处理液（20%甘油，0.1%溴酚蓝，20%浓缩胶缓冲液）等体积混合后用于电泳分析。　　一次性提取方法：丹参种子粉碎后分别称取0.05g，

6、分别加入600μl水，600μl2.5%盐溶液，600μl50%异丙醇和600μlNaOH，在60℃水浴中提取40min，离心取上清液。按分步提取法加入样品处理液后电泳［7］。　　1.2.3电泳方法聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对过氧化物酶和贮藏蛋白进行电泳分析。DYY-III30稳压、稳流型电泳仪（北京六一仪器厂），YY0155-94型电泳槽，采用垂直板凝胶电泳，凝胶板22cm×10cm。凝胶为30%丙烯酰胺、1%甲叉双丙烯酰胺，分离胶10%，浓缩胶3%，以TEMED和过硫酸铵为催化系统，以Tris-甘氨酸为电极缓冲液，1

7、50V稳压条件下电泳4h。　　1.2.4染色胶板剥离后，用于跑过氧化物酶的胶放在联大茴香胺染色液中，间歇性摇动，染色2h，拍照。蛋白电泳的胶放在考马斯亮蓝染色液(0.08%考马斯亮蓝，10%三氯乙酸)中染色2h。　　1.2.5脱色种子贮藏蛋白电泳的胶放至25%甲醇，10%乙酸溶液中脱色直到看到电泳条带，拍照。　　2结果　　2.1丹参叶片过氧化物酶同工酶分析白花丹参在5.1，7.9，8.7cm处各有1条带，共3条；而紫花丹参在6.3，7.5，8.2，8.7cm处各有1条带，共4条（见图1）。说明不同表型的丹参品种间在同工酶分析

8、上存在着差异，理论上可以以此作为品种划分的依据之一。　　2.2丹参种子蛋白质种类的分析用分步提取法对白花丹参和紫花丹参两品种种子提取得到的水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白电泳结果见图2。由分析结果看出，在丹参种子中以盐溶性蛋白为主，水溶性蛋白和醇溶性蛋白较少，碱溶性蛋白含量极