cik细胞对白血病微小残留病作用的研究

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1、CIK细胞对白血病微小残留病作用的研究作者：肖中平封韬王雪野韩梅肖中平【摘要】目的观察CIK细胞对自体、异体原代白血病细胞的杀伤作用，对G0期CD34+白血病细胞的细胞毒作用，及对正常骨髓造血干细胞的影响。方法取急性白血病(AL)化疗后、慢性粒细胞白血病(CML)慢性期及正常人外周血单个核细胞加入一系列细胞因子诱导培养CIK细胞，流式细胞仪检测CIK表型，G带法分析CIK细胞核型。冻存、复苏后作为靶细胞，MTT法测定CIK细胞对自体、异体原代白血病细胞杀伤作用。AO染色法测定复苏后G0期急性粒细胞白血病

2、(AML)CD34+细胞比例及培养后CMLCD34+细胞中G0期细胞比例。流式细胞仪检测CIK细胞杀伤前后G0期CD34+细胞比例变化。半固体培养法检测CIK细胞对正常骨髓CFUGM、BFUE集落形成的影响。结果CIK细胞可从白血病患者外周血中获得，来源于正常淋巴细胞，对自体原代白血病细胞有明显杀伤作用，对G0期白血病细胞有明显抑制作用，对正常造血干细胞无杀伤作用。结论CIK细胞可作为清除残留白血病细胞的有效工具。【关键词】白血病；微小残留病；CIK细胞完全缓解的白血病患者体内，常残存耐药的、处于静

3、止期的微小残留白血病细胞，是复发的根源。本研究从白血病患者外周血中培养出的CIK细胞，不含有白血病干细胞，能有效杀伤G0期CD34+白血病干细胞，而且这种杀伤作用具有选择性，不损伤正常造血干细胞，可以作为有效的免疫细胞来清除白血病患者体内的为微小残留病（MRD），值得临床使用。　　1材料和方法　　1.1对象　　本院血液科2005年1月至2008年10月15例急性白血病（AL）治疗后完全缓解（CR）患者，5例慢性粒细胞白血病（CML）慢性期患者，5例正常人。诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》〔1〕。　　1

4、.2试剂和仪器　　白介素(IL)1，英国PeproTechINC公司；IL2，沈阳三生公司；CD3抗体，美国PharMingen公司；干扰素(IFN)γ，英国PeproTechINC公司；CD3FITC单抗、CD56PE单抗、CD34APC单抗、IgGFITC单抗、IgGPE单抗，美国PharMingen公司；EPICSXL流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司。　　1.3方法　　1.3.1CIK细胞的培养与测定　　（1）CIK细胞的诱导与培养：取15例AL化疗后CR患者、5例CML患者、5

5、例正常人外周血分离单个核细胞，第1天加入IFNγ1000μl/ml,第2天加入CD3单抗50ng/ml、IL21000μl/ml、IL1100μl/ml，诱导培养CIK细胞。（2）流式细胞仪(FCM)检测CIK细胞表型：在培养至第1、2、3周时，分别取105CIK细胞，标记CD3FITC单抗、CD56PE单抗20μl，对照管加入IgGPE、IgGFITC20μl，避光孵育20min，用PBS洗涤后，再加1g/L多聚甲醛固定，4℃避光保存，1l(1×106/ml),加秋水仙胺至终浓度0.03n

6、g/ml,置于37℃、5％CO2孵箱中培育3h后离心、低渗处理、预固定、离心、固定、离心、再次固定、离心、再固定，制备中期染色体标本，Gimsa染色后镜检及摄影。　　1.3.2CIK细胞对急、慢性白血病细胞的杀伤作用　　（1）靶细胞（白血病细胞）制备：取上述患者初诊时骨髓5ml，肝素抗凝，以RPMI1640按2∶1体积混合稀释，将此稀释液缓慢加入含有5mlFicoll的离心管中，2000r/min离心20min后吸取单个核细胞层，以RPMI1640清洗2次后，用含20%胎牛血清和10%DMSO的1640

7、作为冻存保护液，程序降温至-196℃液氮中保存。（2）靶细胞（白血病细胞）复苏：从液氮中取出上述白血病细胞冻存管，迅速放入37℃水中，摇动使其尽快融化，吸出细胞悬液，注入离心管中，加入10ml培养液混匀，1000r/min离心10min，吸弃上清液，再重复用培养液洗1次；培养液稀释细胞至1×106/ml，接种于培养瓶中，培养1～2d，培养后台盼蓝拒染法计数活细胞＞95%后备用。（3）MTT法测定CIK细胞对原代急慢性白血病细胞杀伤作用：将白血病细胞浓度调至1×105/ml，效应细胞即CIK细胞浓度分别调

8、至2×106/ml，5×105/ml，1×105/ml，即效靶比分别为20∶1、5∶1、1∶1。取96孔无菌培养板，实验组加效、靶细胞各100μl，靶细胞对照组（白血病细胞）加靶细胞、培养液各100μl，效应细胞对照组（CIK细胞）加效应细胞、培养液各100μl（每组设3个平行孔），置于37℃、5%CO2孵箱中培养4h。孵育后，各孔加入MTT比色液20μl,再置于37℃、5%CO2孵箱中培养4h。孵育后，1500r/min离心10min，弃