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1、Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选论文.freelanRajicellstraininBlymphoma.METHODS:BALB/cmicemunizedthespleencellsplifiedbyRTPCR.Afterrestrictivedigestionidvectorpb3HSSsuccessivelyandthenelectroporatedintoE.coliXL1Blue.ThespecificFabphageantibodylibraryagainstRajicellstraininhumanBlymphomaeains(VH)andvariableli
2、ghtdomains(VL)ologousurineIgheavychainVregionsequencesandkappalightchainsequences,respectively.CONCLUSION:FabphageantibodylibraryembraneantigensinRajicellsentalfoundationforthefurtherinvestigationofBlymphomaimmunotherapy.Keyphoma;Fab;phageantibodylibrary摘要目的:构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法:
3、以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,.freelAb)在B细胞淋巴瘤免疫治疗中已经获得了令人鼓舞的疗效1,2。但经细胞融合技术获得的mAb本身的一些缺陷限制其在临床上的广泛应用,如抗体是大分子物质,很难透过肿瘤周围的毛细血管和间质进入肿瘤组织内部,致使抗体在肿瘤部位聚集量低,达不到理想的浓度。噬菌体抗体库技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体,不经细胞融合,可制备出针对任何抗原的抗体分子,利用该技术制备的多为小分子抗体片段,穿透性强、抗原性低,易于携带放射性核素或细胞毒性药物,进行导向诊断和治疗3,4。我们从人B细胞淋巴瘤Raji细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞RNA出发,应用噬菌体表面展示技术将全
4、套可变区基因通过抗体Fab段表达在噬菌体的表面,使表型和基因型联系在一起,构建全套Fab噬菌体表面展示文库,并筛选出针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系膜抗原的特异性抗体。1材料和方法1.1材料pb3HSS质粒、宿主菌XL1Blue和辅助噬菌体VCSM13由江苏省血液研究所提供。宿主菌XL1Blue含有四环素(Tet)抗性基因。辅助噬菌体VCSM13含抗卡那霉素(Kana)抗性基因,滴度1∶8×1012,自行培养扩增后4℃保存。Raji细胞、Daudi细胞及胰腺癌Patu8988细胞株由本室保存。Trizol为GIBCOBRL公司产品;SacI、XbaI、XhoI、SpeI等限制性内切酶为Bio
5、lab公司产品;T4DNA连接酶及质粒抽提试剂盒为Promega公司产品;MMLV第1链cDNA合成试剂盒为Fermentas公司产品;胶回收试剂盒为Qiagen公司产品;酶标二抗为Sigma公司产品;TMB底物溶液为TIANGEN公司产品。引物参照美国Scripps研究所鼠源抗体库构建的引物设计,由上海生工公司合成,具体如下（下划线为内切酶位置）:HeavychainFd3′primersIgG15′AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT3′IgG2a5′GTTCTGACTAGTGGGCACTCTGGGCTC3′IgG35′GGGGGTACTAGTCTTGGGTAT
6、TCTAGGCTC3′Heavychainvariable5′primersVH15′AGGTCCAGCTGCTCGAGTCTGG3′VH25′AGGTCCAGCTGCTCGAGTCAGG3′VH35′AGGTCCAGCTTCTCGAGTCTGG3′VH45′AGGTCCAGCTTCTCGAGTCAGG3′VH55′AGGTCCAACTGCTCGAGTCTGG3′VH65′AGGTCCAACTGCTCGAGTCAGG3′VH75′AGGTCCAACTTCTCGAGTCTGG3′VH85′AGGTCCAACTTCTCGAGTCAGG3′VH95′AGGTIIAICTICTCGAGTC(TA)
7、GG3′кlightchain3′primer5′GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA3′кlightchainvariable5′primersVк15′CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT3′Vк25′CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC3′Vк35′CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA3′Vк45′C
