应用细胞内pcr技术构建及筛选白癜风噬菌体抗体库论文

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1、应用细胞内PCR技术构建及筛选白癜风噬菌体抗体库论文刘玲，田艳丽，李春英，高天文【关键词】白癜风；聚合酶链反应；噬菌体抗体库；自身抗体ConstructionandscreeningofhumanvitiligophageautoantibodylibrarybasedonincellPCR【Abstract】AIM:Toobtaininsitupairingofthevariableregiongenesoftheheavyandlightchainsofvitiligopatientslymphocytes,thenconstructa

2、ndscreenahumanScFvphageantibodylibrary.METHODS:erckkGaA公司），PCR引物由赛百盛公司合成，Trizol和逆转录酶SuperScriptⅢ（Invitrogen公司），Cre重组酶（纽英伦生物公司），Taq酶和PCR产物回收纯化试剂盒（TaKaRa公司），限制性内切酶和T4DNA连接酶（Promega公司），噬菌体表达载体PHENI由本校生化教研室雷迎峰博士惠赠，大肠杆菌XLBlue和含卡那霉素抗性的辅助噬菌体VCSM13由本实验室常规保存.1.3扩增体内亲本配对的抗体基因1.3.1分离

3、CD19+B淋巴细胞常规培养人黑素细胞，活细胞ELISA法［5］筛选强阳性血清，抽取相应静脉血各15mL,用淋巴细胞分离液按常规方法分离外周血单核细胞，免疫磁珠分离收集CD19+B淋巴细胞.1.3.2扩增抗体基因按文献［3］扩增人类主要的轻重链可变区基因，所有引物序列：5′GCTGCTGAGGGAGTAGAG3′,5′CAGATTTCAACTGCTCATCAGATGG3′,5′ATGGACTGGACCTGGAGGRTCYTCTKC3′,5′ATGGAGYTTGGGCTGASCTGGSTTTYT3′,5′TCATTCTCGACATAACTTC

4、GTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGAGCCGCCGCCGCCACTGCCGCCACCACCTGARGAGACRGTGACCRKKGTBCC3′,5′CTCGCAACTGCATAACTTCGTGCCATGGCCGMCATCCRG13,37℃振荡2h后加入卡那霉素(70mg/L),37℃振荡过夜.次日，收集菌液4℃5000r/min离心15min，收集上清，加PEG8000至40g/L,NaCl至30g/L，冰浴中沉淀30min,4℃8000r/min离心30min，弃上清，10g/LBSA10g/L甘油PBS溶解沉淀，1

5、2000r/min离心，上清即为噬菌体抗体库，-20℃保存.1.5筛选噬菌体抗体库参照文献［6］，以完整的黑素细胞为抗原对噬菌体抗体库进行4轮富集筛选.2×107个细胞洗涤离心，30g/LBSAPBS1mL,37℃封闭1h，弃封闭液，加噬菌体抗体库液1mL,37℃缓慢颠倒吸附2h.离心弃上清，PBS洗涤（第一轮洗2次，以后每轮洗20次），加入对数期生长的XLBlue菌液2mL,37℃振荡培养30min，取适量铺盘计算回收率，其余转入三角烧瓶，加SB至总体积10mL，37℃振荡培养1h，加入70mLSB培养液和AMP（100mg/L），于37

6、℃振荡培养至对数生长期；加1×l012cfuVCSM13诱导表达，30℃振荡培养过夜.次日将菌液离心收集上清，浓缩后得到次级库，反复筛选4轮.1.6噬菌体抗体的表达和特异性检测1.6.1噬菌体抗体的表达从第3轮和第4轮筛选后的培养皿上分别随机挑取40个菌落各加入到1.5mLLB培养液中(Amp100mg/L,Kan25mg/L)中，37℃振荡培养过夜.补加1.5mLLB，振荡培养1h，加入50μLVCSM13，30℃振荡培养过夜.次日，菌液离心上清即为初步筛得的噬菌体抗体.1.6.2抗体特异性的细胞ELISA检测将黑素细胞接种于96孔培养板

7、上，待贴壁生长后，PBS洗涤加入30g/L的BSAPBS（300μL/孔），37℃封闭1h.弃去封闭液，加入待测噬菌体抗体（50μL/孔），37℃孵育1h.用0.5mL/LTl/LT测定A值.显色阳性的克隆再以黑素瘤细胞系LiBr，375，角质形成细胞、成纤维细胞和角蛋白等为抗原鉴定抗原抗体反应的特异性.2结果2.1扩增ScFv基因细胞内PCR扩增ScFv基因，电泳目的条带约为800bp，与预期大小相符（图1）.M:Marker(DL2000).图1细胞内PCR扩增ScFv基因（略）2.2构建噬菌体抗体库构建的噬菌体抗体库库容约为3×l06

8、，挑20个单菌落提质粒进行SfiI和NotI双酶切、琼脂糖凝胶电泳，19个见800bp左右目的条带，重组率为95%（图2）.2.3筛选噬菌体抗体库用黑素细胞对噬菌体抗体库进行亲和