氧氟沙星噬菌体库的构建、筛选及抗体结构模拟.pdf

《氧氟沙星噬菌体库的构建、筛选及抗体结构模拟.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第42卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第6期2014年6月ChineseJournalofAnalyticalChemistry829～834DOI：10．3724／SP．J．1096．2014．30998氧氟沙星噬菌体库的构建、筛选及抗体结构模拟张秀嫒何扩杜新军王俊平杨青(河北北方学院，张家口075000)(天津科技大学，教育部食品营养与安全重点实验室，天津300457)摘要应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗氧氟沙星单链抗体(scFv)库，筛选获得氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及同源模拟其

2、三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA，用RT—PCR反转录合成cDNA，以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物，扩增获得VH和VL可变区基因，通过SOE—PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker(GlySer)拼接成全长scFv基因片段，将双酶切后的scFv基因片段插入，I7噬菌体，经体外包装后转化宿主菌BLT5403，成功构建库容量为3×10’pfu／mL的抗体库，经4轮吸附一洗脱一扩增的富集，采用直接竞争ELISA筛选到4个特异性噬菌体scFv，运用Ex

3、pasy软件模拟特异性scFv的三维结构。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了基础。关键词氧氟沙星；单链抗体；噬菌体展示；酶联免疫分析1引言氧氟沙星(Ofloxacin)为第三代喹诺酮类抗菌药，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌及阴性菌均有强大的抗菌作用，对厌氧菌和肺炎支原体也有良好作用，广泛应用于畜牧业生产中。喹诺酮类药物对人体有一定副作用，包括对胃肠道不良反应、中枢神经系统不良反应、心脏的毒性作用¨，在牲畜体内的残留毒性会对环境及人体健康造成严重危害。单链抗体作为第三代抗体，应用DNA重组技术及蛋白质工程技

4、术将抗体基因进行加工、改造和重新装配，然后克隆到合适的表达载体中，在适当的宿主细胞中表达并正确折叠成具有生物学功能的一种抗体分子。由于其具有分子小、免疫原性低、可塑性强及不需免疫动物可大批生产等优点，在酶联免疫技术检测环境和食品中抗菌素残留方面显示出前两代抗体无法比拟的优点。目前，还没有关于氧氟沙星噬菌体抗体库构建的相关报道。本研究利用噬菌体表面呈现技术，构建抗氧氟沙星噬菌体单链抗体库，从中筛选出具有抗原结合活性的抗氧氟沙星单链抗体噬菌体阳性克隆，并获得抗氧氟沙星特异性单链抗体的基因序列，为进一步实现氧

5、氟沙星免疫法快速检测提供一种获得抗氧氟沙星特异性抗体的新途径。2实验部分2．1仪器与试剂氧氟沙星杂交瘤细胞为本实验室制备；T7噬菌体(Novagen公司)；pGEM—T—Easy质粒(Promega公司)；大肠杆菌DH5、BLT5403均为实验室保存菌株；卵清蛋白、牛血清蛋白(Sigma公司)；HindⅢ限制性内切酶、EcoRI限制性内切酶、GoScript反转录系统(Promega公司)；17-TagHRP(BBI公司)；Unizol(上海BioStar公司)；DNA凝胶回收试剂盒、Oligotexm

6、RNAMiniKit、QIAquickPCRPurificationKit(Qigen公司)；质粒提取试剂盒(康为世纪公司)；T7select10-3cloningkit(Novagen公司)。2．2引物合成本实验扩增轻链VL和重链VH所用引物是参考NCBI网站的小鼠抗体基因数据和文献[3]所用引物的基础上，利用Primer5和Mega软件设计的兼并引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。2013—10—17收稿；2014-03-24接受本文系国家自然科学基金(No．20905058)，张

7、家口市科技攻关项目(No．1311018C-3)资助}E—mail：hekuo7825@163．cOrl1．tom830分析化学第42卷表1PCR扩增的引物Table1OligonucleotideprimersusedforPCRamplification引物名称Namesofprimer引物序列(5-3)Primersequences轻链前引物VL—ForwardcctttctatgcggcccagccggGAATrCtGAYATrGTWCTCWCCCARTCeetttctatgcggeccagcc

8、ggGAATrCtGAYATTSTGMTSACYCAGTCcetttctatgcggcceageeggGAATYCtGAYATrGTGMTMACTCAGTCeetttetatgcggeeeagccggGAAqq'CtGAYATTGTRATGACMCAGTC轻链后引物VL—Reverse：CCG_r兀'SAGCTCCAGCITGG重链前引物VH—ForwardAKGTRMAGCTrCAGGAGYCAGGTNCAGCTBCAGCAGTCGGTG