高效液相色谱法测定奈韦拉平的血药浓度论文

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1、高效液相色谱法测定奈韦拉平的血药浓度论文【关键词】色谱法,高压液相；奈韦拉平；血药浓度【关键词】色谱法，高压液相；奈韦拉平；血药浓度奈韦拉平（nevirapine）是人体免疫缺陷病毒(HIV1)的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI).奈韦拉平与HIV1的逆转录酶(RT)直接连接并通过使此酶的催化端断裂来阻断RNA依赖和DNA依赖的DNA聚合酶活性［1-2］.奈韦拉平不与底物或三磷酸核苷产生竞争.我们旨在摸索一种简便、快速、专属性高的测定奈韦拉平血浆浓度的方法.1材料和方法1.1材料安捷伦1100液相色谱仪（美国安捷伦公司生产）

2、；低温高速离心机（德国SIGMA公司生产）；振荡器（美国科尔帕默仪器公司生产）；万分之一天平（上海衡平仪器仪表厂生产）.甲醇、乙腈，色谱纯，Merck公司生产；磷酸、磷酸二氢钠、三氯乙酸、三乙胺，AR级，上海化学试剂公司生产.受试制剂：国产奈韦拉平胶囊剂（商品名艾极），批号0309001，每粒200mg.freelg，浙江华海药业股份有限公司生产；参比制剂：进口奈韦拉平片（商品名维乐命），批号304185d，每片200mg，德国勃林格殷格翰生产；奈韦拉平标准品，批号556503002，含量99.8%，浙江华海药业股份有限公司提

3、供.1.2方法1.2.1色谱条件色谱柱：HypersilC18柱（150mm×4.6mm,0.5μm）；流动相：乙腈:0.01mol/L磷酸二氢钠（含0.01mol/L三乙胺，磷酸调pH至5.0）=18:82；流速：1.0mL/min；柱温：45℃；检测波长：240nm；进样量：25μL；灵敏度：0.01AUFS.1.2.2定性获取空白血浆、加入标准品的血浆样品和待测血浆样品的二维色谱图，比较所测成分的保留时间及检测波长是否一致.1.2.3血浆样品的预处理取0.2mL血浆样品，加入20μL500mL/L三氯乙酸，漩涡振荡，4℃

4、下离心5min（15000r/min），取上清液25μL进样，作HPLC分析.1.2.4标准曲线的制备取健康人的空白血浆0.2mL数份，加入奈韦拉平标准品，使其浓度分别为0.1,0.5,1.0,2.0,3.5和5.0mg/L，按血浆样品处理项处理后作HPLC分析.以样品峰面积（A）对药物浓度（C）进行线性回归，计算回归方程.1.2.5回收率与精密度考察配制含奈韦拉平的标准品0.2,2.5,4.5mg/L的系列血样，日内各浓度重复进样5次，日间各浓度测定1次，连续测定5d，以所测的浓度与已知浓度相比，计算血样中奈韦拉平的相对回收

5、率和日内、日间精密度.1.2.6药代动力学参数计算Cmax,tmax用实测值表示，AUC0-t用梯形法计算.AUC(0-∞)=AUC(0-t)+Ct/λZ,Ct为最后一点的血药浓度，λZ为末端相消除速度常数，t1/2可按t1/2=0.693/λZ求出.2结果2.1色谱分离与定性从加入标准品的血浆样品的二维色谱图可知，奈韦拉平在12.165min出峰，比较空白血浆、加入标准品的血浆样品和待测血浆样品的色谱图，奈韦拉平的保留时间基本一致，证明定性成功（图1）.A：空白血浆；B：加入标准品的血浆样品；C：待测血浆样品.图1人血浆中奈

6、韦拉平的高效液相色谱图2.2线性关系回归方程：C=81.45A+58.65,相关系数（r）=0.9995(n=6)，线性范围0.1~5.0mg/L.相关系数的显著性检验P0.001，说明待测成分在所选的范围内线性关系良好.本色谱条件下的最低检测浓度为0.1mg/L.2.3专属性本方法专属性高，在该色谱条件下，测得奈韦拉平保留时间为12.165min，药物峰形良好，血浆中内源性杂质不干扰奈韦拉平的测定.2.4精密度和回收率血样中奈韦拉平的相对回收率和日内、日间精密度，其结果见表1.血样中奈韦拉平的相对回收率为99.41%~100

7、.53%,日内、日间精密度小于10%，符合生物样品分析的有关要求.表1人血浆中奈韦拉平的精密度和回收率2.5血药浓度时间曲线采用二重3*3拉丁方设计，24名受试者按照随机顺序接受3种药物（奈韦拉平国产胶囊剂、片剂与进口片剂）200mg后的平均血药浓度时间曲线见图2.结果显示，血样中奈韦拉平实测浓度均在本试验线性范围内.图2奈韦拉平的平均血药浓度时间曲线3讨论测定人血浆中奈韦拉平浓度的方法有高效液相色谱法［3-4］和离子对色谱法［5］.我们采用高效液相色谱法，血浆内源性杂质不干扰药物的测定.采用磷酸盐缓冲溶液，调节pH=5，以获

8、得较好的分离度和较短的保留时间.该方法符合人体药代动力学研究生物样品测定的方法学要求.本实验中，对于流动相的选择和药物的萃取进行了大量探索工作，固相萃取可得到较高和较稳定的回收率［6］，却代价昂贵，应用500mL/L三氯乙酸作为萃取溶剂，回收率高而且稳定，以乙腈和磷酸盐溶液作