兔vx2肝癌介入治疗后早期发生凋亡的流式细胞术检测

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1、兔VX2肝癌介入治疗后早期发生凋亡的流式细胞术检测【摘要】目的研究经肝动脉插管灌注碘油抗癌药乳液化疗栓塞和单纯灌注化疗后的早期兔肝VX2肿瘤发生凋亡。方法27只新西兰大白兔瘤组织块种植肝VX2肿瘤，A组(n=9)经肝动脉灌注碘油抗癌药乳液,B组(n=9)肝动脉灌注化疗,C组(n=9)肝动脉灌注生理盐水，每组分别在处理后第24h、72h、120h处死实验兔各3只，采用FITCAnnexinV/PI流式细胞术分析介入处理后早期的肿瘤细胞凋亡。结果肿瘤边缘部的凋亡早期细胞百分率（PapE）与凋亡晚期细胞百分率（Pap

2、L）及峰值时间点分别为：A组(9.48±4.58)%、(33.46±8.81)%、24h、72h,B组(4.46±1.47)%、(11.65±3.51)%、24h、24h,C组(2.50±1.39)%、(5.99±1.22)%。肿瘤中心部的PapE、PapL与峰值时间点分别为：A组(16.48±6.32)%、(43.56±18.51)%、24h、72h,B组(7.50±3.10)%、(18.53±14.04)%、24h、24h,C组(5.61±1.92)%、(14.63±12.23)%。结论LpTHACE诱导肝

3、癌肿瘤细胞早期大量凋亡是其有效的主要作用机制，其诱导凋亡作用明显大于THAI。【关键词】流式细胞术凋亡VX2肿瘤肝脏兔肝动化疗栓塞　　0引言　　利用兔VX2肝癌模型进行肝癌治疗学研究，近年已经取得了很大的进步，对指导临床治疗具有积极意义。目前临床上应用的多种非手术性肝癌治疗方法，对肝癌具有确切的疗效，其中经肝动脉碘油化疗栓塞（LpTHACE）或灌注化疗（THAI）是目前治疗肝癌最主要最成熟的介入放射疗法。本文报告采用流式细胞术（Floetry，FCM）检测肿瘤细胞膜完整性及膜转运功能的FITCAnnexinV

4、/PI双染法，定量研究兔VX2肝癌LpTHACE和THAI后早期发生的凋亡，探讨其治疗机制。　　1材料和方法　　1.127只新西兰大白兔，体重每只平均（2.5±0.2）kg，雌雄不限,开腹直视下兔肝左中叶瘤组织块接种建立兔VX2肝癌模型。接种后第3周进行血管造影和介入处理。直视下穿刺右侧股动脉行腹腔动脉、肝固有动脉插管，非离子型造影剂优维显（含碘300mg/ml），DSA方式血管造影。　　1.2将实验兔分为3组A组(n=9)LpTHACE,经肝固有动脉灌注碘油抗癌药乳液(Lipiodol0.3ml+epiru

5、bicin0.5mg)；B组(n=9)THAI，经肝固有动脉灌注epirubicin0.5mg,C组(n=9)为对照组,经肝固有动脉灌注静脉用生理盐水2ml。每组分别在介入处理后第24h、72h、120h空气栓塞法处死实验兔各3只，立即在肿瘤的中心部位、近包膜的肿瘤边缘部位各取大小为5mm×5mm×5mm瘤块，按实体瘤单细胞悬液制备法制成单细胞悬液，用作流式细胞仪分析。　　1.3FITCAnnexinV/PI双染色双参数流式细胞分析法采用FACSVantage流式细胞分析仪(美国BectonDickinson公

6、司)，激发光光源波长为488nm的氩离子激光器。FITCAnnexinV/PI双染法流式细胞分析试剂盒[Bender公司产品：BMS306FI/100T，AnnexinVFITCKit(incl.AnnexinVstainingbufferandpropidiumiodide)]，按说明进行双染操作。每个样本检测计数的细胞数量均固定为10000个，应用CELLQuest软件获取、分析输出试验数据。　　1.4统计学分析采用SPSS10.0软件，GLM方差分析。以P<0.05为有显著性意义，P<0.0

7、1为有非常显著性意义。　　2结果　　2.1FCM术FITCAnnexinV/PI双染法检测散点图表示检测结果,见图1。　　2.2肿瘤边缘部A组、B组和C组对肿瘤边缘部位的影响及变化趋势，见表1、图2。　　散点图左下象限LL：正常细胞簇群，AnnexinV-PI-；右下象限LR：凋亡早期细胞簇群，AnnexinV+PI-，右上象限UR：凋亡晚期细胞或死亡细胞簇群，AnnexinV+PI+；左上象限UL：机械损伤或坏死细胞簇群,AnnexinV-PI+　　图1LPTHACE组兔第24h点肿瘤中心部位细胞凋亡FCM

8、散点图（略）　　2.3肿瘤中心部位A组、B组和C组对肿瘤中心部位的影响及变化趋势,见表2、图3。　　3讨论　　LpTHACE和THAI治疗肝癌的机理目前仍不十分明了，有学者研究经肝动脉化疗栓塞相当长一段时间后的人肝癌手术切除标本，发现存在肝癌细胞凋亡[1]。对于在经肝动脉介入治疗后的早期肝癌细胞凋亡，目前尚缺乏研究报告。本研究采用兔VX2肝癌模型和FITCAnnexin