转基因水稻多重ｐｃｒ和ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｃｒ定性检测中的问题与策略

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1、转基因水稻多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ定性检测中的问题与策略仇娟（湖北省农业科学院粮食作物研究所，武汉４３００６４）摘要：随着转基因水稻研究在世界范围内的研究和开发，以及转基因水稻商业化的争议性加剧，相关部门对粮食安全、食品安全更加关注，农业科研单位检测转基因水稻也将具有重要意义。参照农业部的质检标准书和转基因ＰＣＲ检测中的实践经验，对抗虫转基因水稻在转基因检测中可能出现的问题进行了技术层面和理论层面分析；同时对转基因抗虫水稻的启动子、终止子、内参基因、靶基因等几个元件的检测分别进行探讨，并重点分析了启动子和终止子的检测工作，根据研究者的工作

2、经验报道，从植物病毒学原理和植物基因工程的理论角度，提出了对转基因ＰＣＲ定性检测中可能遇到问题的解决方案。.jyqkeke等［19］在水稻转基因检测的实践中，采取适用于ＲＦＬＰ分子标记检测的水稻ＤＮＡ快速提取法，取得了比较好的效果。３转基因水稻的多重ＰＣＲ检测根据农业部的质检标准书，采用的是多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ的方法。在转基因的检测中，有4个检测元件：启动子、终止子、靶基因、内参基因。转基因的定性检测中，首先要检测的是内参基因，因为内参基因能确定ＤＮＡ模板的质量；然后是检测启动子和终止子，在检测出启动子或者终止子以后，还要进一步检测靶

3、基因。只有两个以上的转基因元件被检测出，才能定性为转基因的水稻［３，４，９，２０］。３．１内参基因的检测在定性检测转基因水稻中，会设置内参基因，农业部的质检标准书采用的是水稻ｓｐｓ（蔗糖磷酸合成酶）基因［３，２1］；也可以采用常规试验中经常用的水稻β－Ａｃｔｉｎ基因的引物（在不同的物种中高度保守，组织和细胞中的表达相对恒定内参基因的检测），可以对模板进行定性为水稻的ＤＮＡ，同时可以根据ＰＣＲ产物条带的亮度来确定模板的质量。３．２启动子的检测３．２．１ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的检测根据农业部制定的质检标准书，在目前的转基因水稻中的定性检测一般检查的是花椰菜

4、病毒３５Ｓ启动子。早期的水稻转基因多采用这个启动子，这次农业部批准的“Ｂｔ汕优６３”也是采用的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子。３．２．２含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的转基因水稻和病毒感染的定性区分转基因食品中ＣａＭＶ３５Ｓ启动子中有一个关键性问题就是区别转基因与病毒感染和污染［２２－２４］。在食品的安检和十字花科蔬菜的转基因定性检测中，通常会检测是否有ＣａＭＶ３５Ｓ启动子转基因元件还是被花椰菜病毒感染了［２２］。但是在确定没有污染的情况下，检测出３５Ｓ启动子并不能定性样品含有转基因成分。花椰菜病毒会感染很多十字花科的蔬菜，病毒基因组也会整合到其侵染的植物基因组里面（

5、感染水稻的可能性很小），在这种情况下，可以根据花椰菜病毒的外壳蛋白基因或复制酶基因设计特异性引物，也可以根据被花椰菜病毒感染后的特殊产物设计特异性引物，在转录水平上来定性是含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子成分的样品还是被花椰菜病毒感染了［２５－３１］。在一般情况下，水稻并不是花椰菜病毒的宿主，被感染的可能性不大，因此，这项检测只有在质量检测要求特别严格的情况下会被采用。同时，通过定量荧光Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ也可以排除样品是被花椰菜病毒感染或者污染还是转基因，具体的方法参见后文关于荧光ＰＣＲ定量检测的内容［３，１０］。３．２．３其他启动子随着转基因技术的不断

6、发展，更多被农业科学家采用的是组织特异性的启动子，例如新一代的转基因水稻就是采用组织特异性表达的启动子［３２］。因此，随着转基因水稻品种越来越多，更多种类的启动子检测将会出现在质检标准中［３３］。３．３终止子的检测３．３．１植物基因工程的原理根癌农杆菌的Ｔｉ质粒和发根农杆菌的Ｒｉ质粒，其特定部位能与植物的ＤＮＡ发生整合，因此常被用作植物基因工程中的载体。３．３．２Ｎｏｓ终止子在转基因植物中，常采用Ｎｏｓ终止子来构建载体，“华恢１号”和“Ｂｔ汕优６３”也是采用的Ｎｏｓ终止子，因此可以按照农业部的质检标准书用ＰＣＲ定性检测Ｎｏｓ终止子［３，３４］。Ｎｏｓ

7、终止子是农杆菌菌株Ｔｉ质粒的Ｔ－ＤＮＡ上的胭脂碱合成酶的终止子。胭脂碱属于冠瘿碱，在与植物共生或者转化植物以后，会释放出对植物有害的毒素，因此在Ｔｉ质粒上构建载体的过程中，会剪切掉这个基因，但是会保留这个基因的终止子（Ｎｏｓ），并通常用这个Ｎｏｓ终止子作为转基因的终止子［３５］。３．３．３其他终止子植物转基因的构建方法表明，转基因载体基本采用的是农杆菌Ｔ－ＤＮＡ上的冠瘿碱的终止子。农杆菌的不同菌株含有不同Ｔｉ质粒，其包含的Ｔ－ＤＮＡ上的冠瘿碱也不同。例如，农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４的毒性区来自章鱼碱型质粒，农杆菌菌株ＧＶ３１０１的毒性区来自胭脂碱型质粒

8、，农杆菌菌株ＥＡ１０１、ＥＡ１０５的毒性区来自琥珀碱型质粒。冠瘿碱有４种类型：章鱼碱（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）、胭