实时荧光定量pcr检测限的统计推断

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1、实时荧光定量PCR检测限的统计推断作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武【摘要】检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQPCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果≥4时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul～4拷贝/

2、ul的概率为0.996，而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1095拷贝/ml的概率为0.997；而100000拷贝/L表示一次抽样结果在997000拷贝/L～1003000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。【关键词】实时荧光定量PCR；检测限；统计推断StatisticalConclusionofLimitofQuqntitationinRealtimeFluorescenceQuantitativePCRAbstract:Limitofqu

3、antiationisaimportantperformanceindexofassaymethods.Resultsofsampledraergedinpopulationisdeduced.Forexample,inRealtimeFluorescencequantitaivePCRtoassayHBVDNA,onlypledraitofquantitationis4copies/uldenoting0inonesampledralto1095copies/mlis0.997.Possibilityof1000

4、00copies/LdenotingresultsbetpledrapledralorL.KeyeFluorescencequantitativePCR；Limitofquantitation;Statisticalconclusion检测限是检测方法的重要性能指标，只有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限，该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。能检测到的最低分析物浓度为检测系统的检测限。当前，检测限术语混乱，如：灵敏度(sensitivity)、分析灵敏度(analllyticalsensi

5、tivity)、定量限度(limitofquantitqtion)等［1］。每个词语的实际含义中包含有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等。我们采用统计学方法，以期得到一致的实时荧光定量PCR(Realtimefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,FQPCR)检测限，现介绍如下。1表1总体为1～9时抽样为0的概率及总体（略）在FQPCR检测HBVDNA中，当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号(即当Ct≥30)，反应管检测结

6、果为0时，推论总体拷贝数为1～9的概率之和>0.58192，总体为其他的概率之和<0.5(此时报告0拷贝的可信限度低于50%)。总体为1时一次抽样结果分别为1～9时的概率见表1。当一次抽样结果≥4时，推论总体为1的概率≤0.01533，所以对于病原体的检测，一次抽样反应管检测结果≥4拷贝时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而上述检测血清中病原体时一次抽样反应管的检测限是4拷贝/μl。当总体为1、2、3时一次抽样结果为0的概率分别是0.36788、0.13534、0.04979

7、。如室间质量评价样本靶值选择1拷贝/μl、2拷贝/μl、3拷贝/μl时，无论实验室实际检测质量如何高，都将有36.79%、13.53%、4.98%的实验室检测结果为0而被判为不符合［按靶值的对数值GM±0.5log(10)［9］作为可接受的定量范围］。2005年卫生部室间质量评价中靶值为1.51拷贝数/μl的样本符合率仅35.2%；ManciniC等［9］报道一些实验室对检测下限附近的样本(3.00logIU/ml)准确定量有困难；RaggiCC等［10］也报道28.6%的实验室(12/42)对最低浓度的样本不能定量

8、。这些都是因为检测下限附近的样本一次抽样结果为0的概率太大所致，对此我们将另文详细讨论。造成上述