外周血干细胞骨髓腔内输注对移植物抗宿主病的影响

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1、外周血干细胞骨髓腔内输注对移植物抗宿主病的影响作者：毕延智,曾冬香,盛桂凤,张琰,陈宝安【摘要】本研究建立髓腔内外周造血干细胞输注(IBMPBSCT)动物移植模型并观察该方法对移植物抗宿主病(GVHD)的影响。选取雌性C57BL/6小鼠为移植受鼠，于第0天接受全身照射(TBI)4Gy后，输注经rhGCSF动员的雄性BABL/c小鼠外周血造血干细胞(1×107)，2天后腹腔注射环磷酰胺(CTX)，观察各组小鼠GVHD发生情况。结果显示：髓腔内PBSCT组的受鼠GVHD发生率较尾静脉输注组明显减低(p<0.05)，移植后在受鼠体内观察到供鼠来源

2、的Y染色体存在。结论：与尾静脉输注比较，髓腔内输注外周血造血干细胞不仅能减少GVHD的发生，而且更有利于干细胞植入。【关键词】移植物抗宿主病InfluenceofIntraboneMarroatopoieticStemCellsonGraftVersusHostDiseaseAbstractThisstudyedtoexplorearroatopoieticstemcells.FemaleC57BL/6miceasrecipientsrecEIvedtotalbodyirradiation(TBI)4Gyonday0,folloatopoiet

3、icstemcells(1×107)frommobilizedmaleBALB/culatingfactor(rhGCSF),andcyclophosphamide(200mg/kg)oreloosomeofdoenormicecouldbedetectedinthebonemarroice.Itisconcludedthatthemethodofintrabonemarroentofhematopoieticstemcellsintermsofstemcellhomingicedecrease.Keyatopoieticstemcelltran

4、splantation;intrabonemarromol/l的PBS液漂洗2次后重悬细胞，调至所需细胞浓度1×109/ml和1×108/ml分别用于髓腔内移植和尾静脉移植。移植模型建立C57BL/6小鼠在移植前1周接受含红霉素(250mg/L)和庆大霉素(320mg/L)的饮水，并持续到移植后2周。移植当天受鼠接受60Coγ射线4Gy全身照射（TBI），剂量率0.5Gy/min。照射后4小时内进行干细胞髓腔内注射和尾静脉注射。髓腔内注射具体步骤如下：将受鼠腹股沟至膝关节间鼠毛刮去，用刀片在大腿作1个5mm左右切口，膝关节弯曲90°，暴露胫骨近端，

5、1ml注射器针头通过髌骨韧带经胫骨关节面插入胫骨骨髓腔内，注入细胞。2天后腹腔注射CTX200mg/kg。实验分为3组：对照组：仅接受TBI和CTX，不进行干细胞移植；TVPBSCT组：尾静脉输注（tailveiniufusion)外周造血干细胞1×107/0.1ml；IBMPBSCT组：髓腔内输注外周造血干细胞1×107/10μl。对照组小鼠5只，其余两组各12只。骨髓细胞染色体制备移植后第15天，取TVPBSCT组和IBMPBSCT组存活小鼠各3只，腹腔内注射0.1%秋水仙碱（4mg/kg），3小时后脱臼处死，无菌取注射侧胫骨，冲洗骨髓腔

6、制备骨髓细胞悬液，离心去上清液，加入37℃预热的0.075mol/lKCl8ml，混匀，在37℃水浴中处理15-20分钟，室温下加入新鲜配制的固定液（甲醇∶冰醋酸3∶1）1ml预固定，离心去上清液。加入固定液8ml，固定30分钟，再次离心去上清液。重复上述操作1次。最后加入1ml固定液，混匀。制片，油镜下计数Y染色体。移植物抗宿主病(GVHD)观察移植后每日观察各组小鼠体重、毛发、腹泻、体位、活动状况等，死亡小鼠取肝脏、脾脏、小肠和爪垫皮肤组织常规病理学检查，若小鼠出现弓背、翘毛、腹泻、精神萎靡和体重骤减等表现，肝、小肠和皮肤等组织病理学改变符合GV

7、HD表现者，定为GVHD死亡。生存期超过30天定为长期生存。统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行处理，数据以均数±标准差（±SD）表示，两样本均数比较采用t检验，GVHD情况分析进行卡方检验，p<0.05为差异有统计学意义。结果小鼠一般状况和GVHD移植后第5-6天开始，TVPBSCT组和IBMPBSCT组部分小鼠出现了弓背、翘毛、食欲下降、体重减轻、精神萎靡及腹泻等不同程度的GVHD表现，未予特殊处理，部分小鼠渐恢复正常，其中TVPBSCT组和IBMPBSCT组分别有3只和2只小鼠在移植后21天内死亡，病理检查符合GVHD表现。

8、肝脏：肝细胞空泡样变，汇管区内有大量淋巴细胞浸润，可见灶状出血；脾脏：巢状结构破坏,可见大量散在浸润的淋巴细