熊果酸对a549细胞增殖、凋亡的影响及其机制

《熊果酸对a549细胞增殖、凋亡的影响及其机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、熊果酸对A549细胞增殖、凋亡的影响及其机制【摘要】目的探讨三萜酸类化合物熊果酸(UrsolicAcid,UA)对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法利用噻唑蓝(MTT)比色法观察UA对A549细胞增殖的影响。流式细胞仪检测UA对细胞周期的影响。用Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞核形态变化。利用免疫印迹法(I1640、PI染料、MTT、RNA酶、Hoechst33258及UA均购自Sigma公司；兔抗人Caspase3多克隆抗体、NFκB单克隆抗体购于美国SantaCruz公司；二甲基亚砜、噻唑蓝为Amresco公司进口分装。1

2、.1.2主要仪器设备流式细胞仪为Beckman公司产品，倒置光学显微镜为Olympus公司产品，荧光显微镜为LEica公司产品，半干转印仪为Biorad公司产品。1.2实验方法1.2.1细胞培养A549细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2的培养箱中培养。取指数生长期细胞用于实验。1.2.2增殖抑制实验将A549细胞浓度调节至1.0×105/L,加200μl于96孔板中，24h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的干预药物),每组设6个复孔，培养一定时间后加入MTT(5g/L)20μl，继续

3、培养4h后吸出上清，每孔加DMSO150μl，振荡溶解10min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长570nm处，空白孔调零，测定各孔吸光度A值。计算增殖抑制率=[(对照组吸光度值－处理组吸光度值)/对照组吸光度值]×100％。用直线回归方程求得UA作用48h后的半数抑制浓度（IC50），此浓度为以下实验的干预浓度。1.2.3细胞周期检测取对数生长期的A549细胞2×105/ml接种于培养瓶中，培养至密度达60%～70%。实验设对照组（不加药物），UA（IC50）均重复3瓶。培养24h、48h后常规收集细胞，PBS洗3次后，70%冷乙醇4℃固定过夜。检测

4、前PBS洗两次,10μg/ml的RNA酶37℃消化0.5h,100μg/ml的PI避光染色30min,置流式细胞仪检测。1.2.4Hoechst33258荧光染色将A549细胞以1×105/ml浓度接种于6孔培养板，每孔2ml，37℃，5%CO2培养24h后加入UA（IC50），使它的继续培养48h，弃去培养基后，用固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）固定20min。PBS漂洗2次后，加入10μg/ml的Hoechst33258，37℃避光染色10min。荧光显微镜下观察细胞核形态。1.2.5in后进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳，用半干转膜仪将

5、蛋白转移至PVDF膜上,5％脱脂奶粉封闭。分别以Caspase3、NFκB抗体进行免疫印迹杂交(兔抗人Caspase3多克隆抗体浓度1∶100和鼠抗人NFκB单克隆抗体浓度1∶1000)4℃下孵育过夜,洗膜后加入辣根过氧化物酶标记二抗(1∶1000稀释)，37℃孵育1h，ECL显色，压片。1.3统计学处理用SPSS11.5软件进行单因素方差分析，半数抑制浓度（IC50）用直线相关与回归法计算。2结果2.1增殖抑制实验20～60μmol/LUA对A549具有一定增殖抑制效果，且呈较明显的浓度和时间依赖性，统计分析表明，除UA30μmol/L与40μmol/L

6、作用A549细胞24h比较，差异无显著性（P＝0.185），UA20μmol/L与30μmol/L作用A549细胞48h比较差异无显著性（P＝0.075）外，其余比较，见表1。经直线回归分析，得UA作用48h的半数抑制浓度IC50＝46.65μmol/L。表1UA对A549细胞的增殖抑制效应:同一时间，与相邻低浓度作用后的抑制率比较，P＜0.05#:同一浓度，与相邻前一作用时间的抑制率比较，P＜0.052.2细胞周期分析结果显示，与对照组相比，UA能引起A549细胞G0/G1期阻滞，见图1。46.65μmol/LUA作用A549细胞24h后，G0/G1期细胞由（5

7、5.5±3.1）%增加到（63.5±3.4）%(P<0.05)，作用48h后上升更为明显，为（73.0±3.5）%(P<0.05)。2.3Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态改变46.65μmol/LUA作用A549细胞48h后，和处理，用荧光显微镜观察，可以看到细胞出现凋亡现象，凋亡细胞的细胞核固缩，染色质凝集或核片段形成凋亡小体，见图2a。对照组细胞荧光染色较浅且较均匀，未见凋亡细胞，见图2b。2.4,etal.ApoptoticactivityofursolicacidmaycorrelateulatesapoptosisinHT29ce

8、llsfo