实时荧光定量pcr技术详解和总结

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1、实时定量PCR技术目录实时定量PCR基本原理实时定量PCR实验材料实时定量PCR实验方法实时定量PCR实验结果实时定量PCR基本原理实时定量PCR的定义实时定量PCR标准曲线定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析实时定量PCR的定义定量PCR三个基本概念扩增曲线指数增长期平台期线性增长期背景期阈值与C(t)值阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期C(t)值：荧光信号（扩增产

2、物）到达阈值时所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04定量PCR的数学原理理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:logXn=log(X0(1+Ex)n)整理方程式得:logX0=(-log(1+Ex)

3、)×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+logXc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系实时定量PCR标准曲线定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到

4、域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量定量PCR的实验步骤标准菌株DNA的提取QPCR探针和引物的设计阳性克隆质粒的构建荧光定量PCR反应定量标准曲线重复性实验灵敏性实验实验材料