花椒抗宫颈癌caski细胞作用及其机制的初步研究

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1、花椒抗宫颈癌Caski细胞作用及其机制的初步研究袁太宁，肖长义，汪鋆植【摘要】　　目的研究花椒挥发油抗宫颈癌Caski细胞作用及其可能的机制。方法花椒挥发油按不同时间（24,48,72h）及不同浓度(0.5～8mg/ml)分别处理Caski细胞，MTS法分析细胞的增殖速度，用流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期。结果4mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72h可显著地抑制Caski细胞增殖，1mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72h即可导致亚凋亡峰的出现，且G0/G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞减少。结论花椒挥发油可抑制Caski细胞增

2、殖并诱导细胞凋亡。【关键词】花椒Caski细胞细胞凋亡　　花椒不仅是深受民众喜爱的重要食用性香料，还是常用的中药材，其资源在我国分布很广，具有很高的安全性。花椒挥发油是花椒主要成分之一,其含量为1%～6%(产地不同含量也不同)。油中主要成分为棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等。国内外研究报道花椒对镇痛、镇静、抗炎、杀菌、抗病毒、抗真菌、抗氧化等均具有较强的药理学活性〔1～4〕。随着对花椒提纯和药理作用的深入研究,发现花椒还具有抗肿瘤作用，但目前对花椒抗肿瘤的研究还不够深入，其体内外的抗肿瘤机制仍不明了。为了认识花椒抗癌作用的机制

3、和特点，我们选用宫颈癌Caski细胞为研究对象，观察了花椒对该细胞的抑制作用，以期探讨花椒抗肿瘤作用及其可能的机制。　　1材料与仪器　　花椒，采于湖北省宜都县，经汪鋆植博士鉴定为Zanthoxylumbungeanum。Caski细胞由三峡大学分子生物学研究所提供；MTS细胞增殖分析试剂由Promega公司提供；其他化学试剂来自Sigma公司和华美公司；EPLCSXL流式细胞分析仪为BecmanCoulter公司产品；全波长酶标仪为为Thermo公司产品；R206D旋转蒸发器为上海申生科技有限公司产品；超声破碎仪为北京君合华科技发展有限公司产

4、品。　　2方法　　2.1花椒挥发油制备使用旋转蒸发器提取花椒挥发油并过滤除菌，称取适量挥发油加入5%Tin，用RMPI1640无血清培养基倍比稀释成8，4，2，1，0.5mg/ml的浓度。　　2.2Caski细胞培养Caski细胞接种于含10%小牛血清的RMPI1640培养液,青霉素100μg/ml,链霉素100μg/ml。置于37℃，5%CO2培养箱中常规培养。　　2.3细胞增殖分析将对数生长期的Caski细胞以4×107/L；细胞数接种于圆底96孔培养板,每孔50μl。37℃培养24h后,向孔内直接加入含不同浓度花椒挥发油的RPMI164

5、0培养基50μl。在加入药物后选定的时间点(24，48，72h),向每孔中加入20μlMTS试剂,37℃继续保温2h显色,于490nm波长下读取OD值。　　细胞生存率（%）=OD药物/OD对照×100%；　　细胞生长抑制率（%）=(100-细胞生存率)×100%　　2.4流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期取1×106对照细胞或经花椒挥发油处理的细胞,用冰冷PBS洗涤1次后,再悬浮于500μl低渗DNA染色液中(1g/LSodiumCitrate,0.1%TritonX100,100mg/LRNase,50mg/LPropidiumIodode)

6、,4℃保温30min后,经流式细胞仪分析凋亡细胞及细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。　　PI（%）=（S+G2/M）/(G1+S+G2/M)×100%　　2.5统计学处理　数据用±s表示，采用组间t检验进行统计分析。　　3结果　　3.1花椒挥发油抑制Caski细胞的增殖花椒挥发油对Caski细胞增殖呈明显抑制作用，且这种抑制随药物浓度加大和药物作用时间延长而增加（见图1）。花椒挥发油浓度为4mg/ml时，24h抑制率为20%,48h抑制率为46%,72h抑制率为78%。　　3.2花椒挥发油诱导Caski细胞的程序性凋亡因发生凋亡的细

7、胞核内,部分DNA发生片段化降解而丢失,经PropidiumIodode染色后,这部分细胞核将出现在G1峰之前,即亚凋亡峰的位置。1mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72h即可导致亚凋亡峰的出现。所以花椒挥发油可诱导Caski细胞的程序性凋亡。　　3.3花椒挥发油抑制Caski细胞周期的正常转换1mg/ml花椒挥发油作用72h后G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，作用具有明显的剂量依赖性（见图2），显示花椒挥发油可有效抑制细胞周期的正常转换,使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G2/M期，从而阻止细胞的有丝分裂,使细胞增殖受到抑制。

8、　　图1花椒对宫颈癌Caski细胞生长的影响（略）　　图2花椒作用72h对宫颈癌Caski细胞周期的影响（略）　　4讨论　　前人研究表明传统中药可通过抑制肿瘤细胞增