氢盐水对小鼠实验性肝损伤保护作用及其机制研究硕士学位论文

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1、第二军医大学硕士学位论文氢盐水对小鼠实验性肝损伤保护作用及其机制研究姓名：孙汉勇申请学位级别：硕士专业：外科学（普外）指导教师：周伟平;王红阳20100501氢盐水对小鼠实验性肝损伤保护作用及其机制研究摘要研究背景和目的：氧化应激在肝脏疾病的发生发展过程中有着重要的作用。氧化应激主要是因为自由基的产生与清除失衡。生理情况下，体内自由基不断产生，也不断被清除，使之维持在一个正常生理水平上，自由基过多或过少均会给机体造成不利影响甚至伤害。生物体内自由基类型有很多，研究比较多的是氧自由基和氮自由基。氧自由基包括超氧阴离子、单

2、线态氧和羟自由基，常共称为活性氧。比较重要的氮自由基有一氧化氮和过氧亚硝基阴离子。实验研究表明抑制自由基的产生或通过生化反应清除自由基可以保护肝损伤。研究表明氢气能够选择性地清除羟自由基和亚硝酸阴离子(氧化损伤的最重要介质)，而对毒性作用较弱的过氧化氢和一氧化氮无效。研究人员在多种动物模型上验证了呼吸氢气对脑、心脏、肝脏的缺血再灌注损伤以及小肠移植都有保护性作用。但是通过呼吸道吸入氢气的方法很不方便而且存在安全隐患，于是我们将氢气通过高压溶解于生理盐水中(简称氢盐水)，同样这种含有氢气的生理盐水在脑缺血再灌注损伤动物模

3、型中有很好的保护作用。但氢盐水是否对肝损伤有保护作用，本课题以Galn／LPS、CCl。、DEN三种肝损伤小鼠模型，验证氢盐水对急、慢性肝损伤的保护作用；并初步探讨其作用的可能机制。研究方法1．运用氢微电极，在体动态监测注射氢盐水后小鼠肝脏、肾脏等器官的氢浓度的改变。2。分别通过腹腔注射Galn／LPS、DEN和强饲CCl。建立小鼠急性肝损伤模型，不同的时间点收集血清及肝脏标本。3．运用自动生化分析仪检测血清中转氨酶；酶联免疫吸附反应(ELISA)检测血清中炎症因子(TNF-a，IL一6)。4．HE、免疫组化检测肝脏形

4、态学改变、炎症细胞浸润。5．TUNEL法结合Westernblot检测肝细胞凋亡。6．使用Westernblot，ELISA及肝组织冰冻切片特异染色等方法开展氢盐水发挥保护作用的机制研究。7．强饲CCln建立小鼠肝硬化模型，通过形态学相关检测及Westernblot方法验证氢盐水对肝纤维化的作用。8．小鼠腹腔注射DEN建立损伤模型，Edu试剂盒验证氢盐水对肝细胞损伤后代偿性增殖的作用。结果笫二军医大学硕士学位论文(一)、经腹腔注射氢盐水后，小鼠肝脏、肾脏内氢浓度5分钟后达高峰，随后慢慢降低，约40分钟后恢复至正常水平。

5、(--)、氢盐水对Galn／LPs诱导的急性肝损伤的保护作用1．Galn／LPS诱导的急性肝损伤中，氢盐水组转氨酶(ALT、AsT)、炎症因子(TNF-Q、IL-6)水平较生理盐水对照组明显下降。2．HE、免疫组化检测显示氢盐水对损伤后肝脏形态结构有明显保护作用，巨噬细胞浸润明显减少。3．氢盐水组肝细胞凋亡明显少于对照组。4．氢盐水主要通过清除肝组织细胞内ROS，抑制JNK磷酸化及caspas一3激活进而抑制凋亡。(三)、在CCl。诱导的肝损伤模型中，氢盐水不仅降低血清转氨酶、炎症因子水平还抑制肝纤维化形成。(四)、D

6、EN诱导的肝损伤模型中，氢盐水不仅减轻肝损伤还抑制损伤后肝细胞的代偿性增殖。结论本研究发现氢盐水不仅能减轻急性肝损伤还可以抑制肝纤维化的形成及损伤后肝细胞代偿性增殖。通过抑制ROS—JNK—caspase一3通路发挥其对肝损伤的保护作用。关键词：氢盐水，急性肝损伤，肝纤维化，肝细胞代偿性增殖，活性氧簇，炎症，凋亡，c—Jun氨基端激酶氢盐水对小鼠实验性肝损伤保护作用及其机审l研究AbstractBackgroundandAims：Reactiveoxygenspecies(ROS)areconsideredtoplay

7、aprominentcausativeroleinthedevelopmentofvarioushepaticdisorders．Antioxidantshavebeendemonstratedeffectivelytoprotectagainsthepaticdamage．Hydrogen(H2)，anewantioxidant，wasreportedtoselectivelyreducethestrongestoxidants,suchashydroxylradicals(-OH)andperoxynitrite(

8、ON00-)，anddidnotdisturbmetabolicoxidation—reductionreactionsordisruptROSinvolvedincellsignaling．IncontrasttoH2gas，hydrogen-richsaline(HS)maybemoresuitableforclinicala