人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定【论文】

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1、人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定作者：小小小作者：蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊，汪蕾【关键词】腺病毒科ConstructionandidentificationofhumanHCN4generecombinantadenovirus【Abstract]ATM:ToconstructtherecombinantadenovirusofhumanIICM4gene.METHODS:IICN4genefragmentwasclonedintotheshuttleplasmidpA

2、dTrackCMVtoformthetransfcrvectorbythemethodsofhomogcncousrccombinationinbacteriaemdtherecombinantadenoviruswasthentransfectedinto293cellsusingLipofectamine2000.Thetargetgenewasdetectedbypolymerasechainreaction(PCR)andthetiteranditsinfectionrateweredeter

3、minedusingthegreenfluorescentprotein(GFP)expressionintheshuttieplasmid.RESULTS:RestrictionenzymedigestionanalysisandthesequenceancilysisconfirmedthattheI1CN4genewassuccessfullyinsertedintotheadonovimsvector.Thetiteroftherccombineintadonovimswas2.OX1015p

4、fu/L.GFPwasobservedinthetransfected293cellsunderafluorescentmicroscope.CONCLUSION:TherecombinantadenoviruscontaininghumanHCN4geneissuccessfullyconstructedbythemethodofhomogeneousrecombinationinbacteria.【Keywords]HCNgene;adenoviridae;recombination,geneti

5、c【摘要】目的：构建超极化激活环核营酸门控通道基因(HCN4)重组腺病毒载体.方法：采用基因工程技术，将HCN4cDNA定向克隆至穿梭载体pAdTrackCMV中，利用pAdcasyl系统进行细菌内同源重组后，脂质体转染293T细胞包装、扩增，CsCl密度梯度超速离心纯化.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，利用穿梭质粒屮带冇绿色荧光蛋白GFP报告基因，对病毒滴度和感染效率进行监测.结果：测序结果证明成功构建了HCM4基因重组腺病毒载体，病毒滴度达2.0X1015pfu/L.结论：应用细菌内同源重组法

6、成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.【关键词】HC7基因；腺病毒科；重组，遗传0引言起搏电流(If)在窦房结生理性起搏机制小担当重要角色，同时也是自主神经调节心脏节律的主要靶点，其编码基因为超极化激活环核营酸门控通道基因(HCN)[1-4]・HCN超家族包括HCN1〜HCN4型，其中HCN4占窦房结HCN总mRNA的80%[5]・最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系屮存在HCN4D553N或1613delC位点突变[6,7]・为了进一步深入研究HCN4的通道动力学及其在起搏活动中的

7、功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因治疗，我们构建了表达HCN4的重组腺病毒载体.1材料和方法1.1材料腺病毒细菌内同源重组系统包括E.coliBj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒骨架质粒pAdcasyl（美国JohnsHopkins大学Dr.HeTC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏屮心）；各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、RNaseA（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine2000（GibcoBRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Prome

8、ga公司）；质粒提取试剂盒（HispeedPlasmidMidiKit,QIAGEN公司）；氯化锥（Sigma公司）.其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂.1.2方法1.2.1穿梭载体pAdTrackCMVIICN4的构建和鉴定1.2.1.lpAdTrackCMVHCN4的构建质粒pcDNA3.1HCN4用Hindlll和XbaI双酶切后回收4.7kb的HCN片段.穿梭质粒pTrackCMV用Hindlll和XbaI双酶切后冋收载体骨架，T4DNA连接酶