β-半乳糖苷酶的诱导合成

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1、实验一β-半乳糖苷酶的诱导合成8/21/20211一.实验原理大肠杆菌细胞在培养过程中，添加诱导剂（乳糖或其他半乳糖），能迅速诱导β－半乳糖苷酶的合成。该酶的诱导合成受葡萄糖的阻遏，称为分解代谢物阻遏，而环腺苷酶（cAMP）可使分解代谢物阻遏作用解除。8/21/202128/21/202138/21/20214试剂和材料1）大肠杆菌菌株。2）营养肉汤培养基：蛋白胨5％，牛肉膏3％，NaCl5％，pH7。3）0.1mol/L葡萄糖溶液。4）0.1mol/L乳糖溶液。5）cAMP钠盐溶液：配成0.1mol/L。6）甲苯。7）邻-硝基酚-β-D半乳

2、糖苷（ONPG）溶液：称取40mgONPG，溶解于100ml，pH7.4，0.1mol/L磷酸缓冲液中。8）0.1mol/L，pH7.4磷酸缓冲液。9）水浴恒温振荡器。10）恒温水浴槽。11）分光光度计。8/21/20215操作方法1.将5％培养过夜的大肠杆菌种子液接种于40ml营养肉汤培养基中，于37℃振荡培养。2.当OD550达0.3左右时（约40min），分装到4根L-试管中，每管8.5ml培养液。（记得标上编号）8/21/202162）4根L-试管分别添加：①1.5ml无菌水（建议标编号：A1，2，3，4）②0.5ml乳糖溶液和1ml

3、无菌水；③0.5ml乳糖溶液，0.5ml葡萄糖溶液和0.5ml无菌水；④乳糖溶液.葡萄糖溶液和cAMP-Na溶液各0.5ml。8/21/202173）将4根L-试管同时于37℃振荡培养，每隔20min，分别取出2ml培养液于小试管中，各加一滴甲苯，于37℃振荡30min置冰箱以备酶活力测定。（记得标上编号）8/21/202184.B-半乳糖苷酶的活力测定：取上述甲苯处理的细胞悬浮液,各取1.5mL，分别加入3mlONPG溶液作为底物，于30℃反应10min分别测定反应前后的OD420(若OD>1.0,则需稀释）8/21/20219在420nm

4、波长下，按上述条件测定的光密度每变化0.001定义为酶的一个活力单位，即：酶活力（单位）＝△OD420×10008/21/202110思考题：1.本实验的原理是什么？试分析，不同组别添加物对β－半乳糖苷酶合成的影响。2.试分析实验的结果和理论结果的差异，试分析其原因。8/21/2021118/21/2021128/21/2021138/21/2021148/21/2021158/21/2021168/21/2021178/21/2021188/21/2021198/21/2021208/21/2021218/21/2021228/21/202

5、1238/21/2021248/21/2021258/21/202126一、操纵子(operon)细菌能随环境的变化，迅速改变某些基因表达的状态，这就是很好的基因表达调控的实验模型。人们就是从研究这种现象开始，打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。8/21/2021271.操纵子的提出大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。8/21/202128大肠杆菌利用乳糖至少需要两个酶：促使

6、乳糖进入细菌的半乳糖透过酶(lactosepermease)和催化乳糖分解第一步的－半乳糖苷酶(-galactosidase)。8/21/202129在环境中没有乳糖或其他-半乳糖苷时，大肠杆菌合成-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖2-3分钟后，细菌大量合成-半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前，也能测出细菌中-半乳糖苷酶活性显著增高的过程。8/21/202130这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳

7、糖的适应现象，法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵子（lacoperon）学说。8/21/2021312.操纵子的基本组成乳糖操纵子模型已被许多研究实验所证实，对其有了更深入的认识，并且发现其他原核生物基因调控也有类似的操纵子组织，操纵子是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵子的形式组成基因表达调控的单元。下面就以乳糖操纵子为例子说明操纵子的最基本的组成元件（elements）。8/21/202132(1)结构基因群操纵子中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(

8、structuralgene,SG)。一个操纵子中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放阅读框(openreadingframe),5