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《北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重pcr检测方法建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
摘要为了解北方某地区牛群中布鲁菌病的疫情，采取更为有效的防控措施，本文利用虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）和间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）随机对该地区牧场及散养牛群进行了布鲁菌病流行病学调查，同时对以上三种方法的检测水平进行了比较；根据GenBank已发表的布鲁菌基因序列计合成三对特异性引物，建立了同时检测布鲁菌属及牛、羊种布鲁菌的诊断鉴别性多重PCR方法，并对其进行了初步应用。用上述三种方法随机对北方某地区牧场和散养牛的950份血清进行布鲁菌病血清抗体检测，表明该地区布鲁菌病流行情况较为严重，但不同群体阳性率差异较大，牧场阳性率最高达50%，最低阳性率仅为4.6%，种牛场未检出阳性血清，散养奶牛阳性率为39.3%；RBT检出阳性血清105份，阳性率为15.8%，SAT检出阳性血清128份，阳性率为19.2%，I-ELISA检出阳性血清262份，阳性率为27.6%，结果表明I-ELISA阳性率最高，SAT次之，RBT最低。所建立多重PCR方法的敏感性可达100pg左右，且具有很好的特异性与重复性，对7株参考株葡萄球菌26001等的PCR扩增均为阴性，初步临床样品应用表明该方法可用于乳样、阴道及粪便棉拭的检测。关键词：布鲁菌病；流行病学调查；多重PCR；应用 BovineBrucellosisSerologicalInvestigationinaRegionofNorthChinaandFormationofMulti-PCRDetectingforBrucellosisAbstactTounderstandthesituationofbrucellosisinaregionofnorthChinaandapplythemoreeffectiveprecautions,thisstudyappliedepidemiologicalsurveystochasticallyinthegrazingfarmsanddistributivecattlegroupsinthisregion,usingRoseBengalPrecipitationTest(RBT),SerumAgglutinationTest(SAT)andIndirectEnzymeLinkedImmunosorbentAssay(I-ELISA),andcomparedthethreeexperiments,respectively.BasedonthebrucellosisgenesequencepublishedonGenBank,specializedprimerwassynthesized,multi-PCRidentificationanddiagnosisofBrucellaandbrucellosisoncowsandsheepwereestablishedandprimaryapplicationtestwasalreadyconducted.Stochasticallyusingthethreemethodsabove,950serumsamplesfromthegrazingfarmsanddistributivecattlegroupsinaregionofnorthChinawereinspected.Resultsshowedthattheepidemicsituationofbrucellosisisrelativelyserious.However,positiveratesgreatlyvaryamonggroupswiththehighest50%andthelowest4.6%inthegrazingfarmsandnobrucellosiswerefoundinthebreedingbullfarmsandthepositiverateindistributivecattlegroupswas39.3%;RBTtested105serumsamplesandthepositiverateis15.8%;SATtested128serumsamplesandthepositiveratewas19.2%;I-ELISAtested262serumsamplesandthepositiveratewas27.6%.ResultsshowtheI-ELISAenjoysthegreatestpositiverate,higherthanSATandRBT.RBTranksasthelast.Thesensitivityofmulti-PCRcouldreachapproximately100pg,possessingexcellentspecificityandrepeatability.PCRamplificationof7staphylococcussamplesappearednegative.Primaryclinicalsampleapplicationsindicatethismethodcouldbeusedfordairysamples,vaginaandexcrementcottonswabtest.KeyWords:Brucellosis;Epidemiologicalsurvey;Multi-PCR;ApplicationDirectedby:Prof.XininigenApplicantforMasterdegree：YunTao(preventiveveterinaryscience)(CollegeofVeterinaryMedicine.InnerMongoliaAgriculturalUniversity.Huhhot010018.China) 目录1引言............................................................11.11.21.2.11.2.21.2.31.2.41.2.51.2.61.2.71.2.81.31.41.51.5.11.5.21.5.31.61.6.11.6.21.6.31.7布鲁菌病概述................................................1病原学......................................................1形态特征..................................................1生长及培养特性............................................1种属分型..................................................2分子生物学特征............................................2抗原结构..................................................2变异性....................................................2抵抗力....................................................3致病性与感染机制..........................................3流行病学....................................................4临床症状....................................................5诊断方法....................................................5病原学诊断................................................5免疫学诊断................................................6分子生物学诊断............................................8布鲁菌病疫苗...............................................10弱毒苗...................................................10灭活疫苗.................................................11新型疫苗.................................................12本研究的目的意义...........................................122实验一：北方某地区牛布鲁菌病血清学调查.........................132.12.1.12.1.22.1.32.2材料.......................................................13被检血清.................................................13主要试剂.................................................13主要设备.................................................13血清学检测.................................................132.2.12.2.22.2.32.2.4被检血清分离及保存.......................................13虎红平板凝集试验（RBT）..................................13试管凝集试验（SAT）......................................14间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）..........................14 2.32.4结果.......................................................15讨论.......................................................163实验二：多重PCR方法的建立.....................................173.13.1.13.1.23.1.33.1.43.23.2.13.2.23.2.33.2.43.2.53.2.63.2.73.2.83.33.3.13.3.23.3.33.3.43.3.53.3.63.4材料.......................................................17菌株.....................................................17临床样品.................................................17主要实验仪器.............................................18主要试剂.................................................18多重PCR方法的建立.........................................18引物的设计与合成.........................................18核酸提取.................................................18引物特异性验证...........................................19引物交叉特异性鉴定.......................................20PCR产物纯化测序鉴定......................................20多重PCR反应条件优化.....................................20多重PCR方法验证.........................................21临床样本初步应用.........................................21结果.......................................................21引物特异性结果...........................................21引物交叉特异性结果.......................................22PCR产物测序鉴定结果......................................23多重PCR反应条件优化结果.................................25多重PCR验证结果.........................................25临床样本初步应用结果.....................................29讨论.......................................................314致结论...........................................................32谢..........................................................33参作考者文简献....................................................34介....................................................40 缩略词表OIE(OfficeInternationalDesEpizooties)WHO(WorldHealthOrganization)pH(hydrogenionconcentration)LPS(lipopolysaccharidecomplex)OMP(outermembraneprotein)RBT(rose—bengalplateagglutinationtest)SAT(serumagglutinationtest)i-ELISA(indirectenzyme-linkedimmunosorbentassay)世界动物卫生组织(原国际兽疫局)世界卫生组织氢离子浓度指数脂多糖复物外膜蛋白虎红平板凝集试验试管凝集试验间接酶联免疫吸附试验c-ELISA(competitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay)PCR(polymerasechainreaction)RT-PCR(real-timefluorescencepcr)bp(basepair)Tm(meltingtemperature)竞争酶联免疫吸附试验聚合酶链式反应实时荧光PCR碱基对解链温度 内蒙古农业大学硕士学位论文111.1引言布鲁菌病概述布鲁菌病(Brucellosis）是由布鲁菌（Brucella）属细菌引起的一种人畜共患传染病，简称布病，也称波浪热、马耳他热等[1]。布鲁菌的感染力很强，可感染人及多种家畜、野生动物，主要临床症状和病理损伤：波浪热，流产及不孕不育、慢性关节炎和神经损伤等。可造成严重的公共卫生问题，并带来巨大的经济损失[2]。世界动物卫生组织（OfficeInternationaldesEpizooties,OIE）将布鲁菌病列为B类动物疫病，《中华人民共和国动物防疫法》将它列为二类动物疫病。布鲁菌病一直缺乏有效的特异性治疗方法，采用现有抗菌药物的治疗效果有限，因其危害严重，治疗困难所以一直是医学研究领域的重点关注对象。据世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO）报告，由于滥用抗生素及生态环境的变化等因素，引起病原微生物变异，布鲁菌的致病性也日趋严重[3]。在全球，每年大约新增50万布鲁菌病患者。美国农业部统计报告，布鲁菌病每年在拉丁美洲可造成至少6亿美元的巨额经济损失。在我国，尤其是畜牧业生产比重较大的省（自治区），布鲁菌病广泛流行。据中国农业部畜牧业疾病情报中心和中国疾病预防与控制中心报告，每年新发人布鲁菌病例上几万人，百万头只牛、羊、猪受到感染，预计至少造成十几亿人民币的经济损失。更为严重的是近年该病发病率呈明显上升趋势，不仅严重威胁到了畜牧业生产，更对人类健康造成了极大危害。1.21.2.1病原学形态特征布鲁菌呈球状、球杆状或短杆状。大小为0.5～0.7×0.6～1.5µm，无鞭毛，不产生荚膜，不形成芽孢。菌体可被碱性染料着色：革兰氏染色阴性呈红色；姬姆萨染色呈紫色；柯兹罗夫斯基染色呈红色，其他细菌呈绿色或蓝色[1,6,7,11]。1.2.2生长及培养特性布鲁菌兼性需氧，为呼吸型代谢，培养所需营养要求较高，最适宜在pH6.6～7.4，温度36～37℃环境下生长。布鲁菌生长缓慢，主要是迟滞期和每分裂一次需要时间较长，尤其是初代分离培养，一般需5～10天，甚至需20～30天[6,8]。固体培养基：光滑（S）型菌落为无色透明，表面光滑隆起的大小不等圆形菌落，一般直径为0.5～1mm；粗糙（R）型菌落不透明，多颗粒状，表面灰暗，呈白色或浅黄到褐色。在液体培养基中呈均匀混浊生长，不形成菌膜[6,7,8]。 2北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立布鲁菌能分解葡萄糖产生少量酸，不液化明胶，不凝固牛乳，不产生吲哚，不分解甘露糖，VP及MR实验均呈阴性[11]。1.2.3种属分型根据致病性及宿主范围的不同将布鲁菌属分为6个种19个生物型分别为流产布鲁菌（B.abortus），又称牛种布鲁菌，有8个生物型；马耳他布鲁菌（B.melltensis）又称羊种布鲁菌，有3个生物型；猪种布鲁菌（B.suis），有5个生物型；绵羊附睾种布鲁菌（B.ovis）、沙林鼠种布鲁菌（B.neotormae）、犬种布鲁菌（B.canis），后3个种各有1个生物型[4]。此外，近年人们从水生动物中分离到布鲁菌，有学者提出将它们分为两个种，即鳍足类海洋布鲁菌（B.pinnipediae）和鲸类海洋布鲁菌（B.cetaceae)[5]。不同种型的布鲁菌具有极为明显的宿主危害倾向性，但大多具不同宿主间的交叉感染能力。人和羊对B.melitensis高度易感，引起的损伤也最严重；而B.abortus对牛则高度易感，危害严重，但对人的危害性及易感性相对较弱；B.suis危害也较为严重，对人和猪均表现出较高的易感性。1.2.4分子生物学特征布鲁菌基因组以两个环形染色体的形式存在，大环约200多万碱基，小环约100多万碱基，总大小300多万碱基。布鲁菌6个种DNA的C+G%均处于56%～58%之间[13]；6个种DNA同原性皆在87%以上，同源性很高[1，2，12]。1.2.5抗原结构布鲁菌的抗原结构较为复杂，分为：属内抗原，主要包括表面抗原A、M、R等。A抗原为牛种布鲁菌的主要抗原，其A抗原和M抗原的比例为20:1；M抗原为羊种布鲁菌的主要抗原，其M抗原与A抗原的比例为20:1；猪种布鲁菌A抗原与M抗原的比例为2：1[9，11]。利用A、M、R血清抗原设计的凝集试验对布鲁菌种属分型有重要意义[10]。A抗原和M抗原存在于光滑型布鲁菌，大多数非光滑型布鲁菌共同的抗原决定簇为R抗原。但沙门氏菌、巴氏杆菌、弧菌、弯曲菌、大肠杆菌、耶尔森菌、钩端螺旋体等属的细菌可与属外抗原发生交叉凝集反应，影响凝集试验。 内蒙古农业大学硕士学位论文31.2.6变异性绵羊附睾种布鲁菌（Br.otis）及犬种布鲁菌（Br.canis）是稳定的粗糙型（R）菌，其它种布鲁菌为光滑型（S）菌。在外界及自身因素的影响下，布鲁菌会产生几种形式的变异。最常发生的是S型菌至R型菌的变异，有时会出现中间过渡（SI）型和中间（I）型，以及粘液（M）型。发生S-R变异后，细菌特性多糖链改变，丧失A和M抗原而露出非特异性R抗原，毒力减弱，凝集原性变差，对吞噬细胞缺乏抵抗力，易发生自凝现象[6]。1.2.7抵抗力布鲁菌对外界环境的抵抗力较强，对低温、干燥有很强的耐受力。可在鲜牛奶、皮毛等中存活数月。但对常用消毒剂、紫外线、热等均很敏感。在1～10%来苏尔溶液，3%苯酚溶液，紫外线照射，80～100℃干热，60℃湿热均可快速灭活[6]。1.2.81.2.8.1致病性与感染机制致病性布鲁菌主要通过其粘附力和侵袭力实现对人及其他动物的致病作用。侵入宿主体内的布鲁菌有抵抗机体防御的能力，在体内生存繁殖，并能产生多种毒力因子。布鲁菌能抵抗宿主防御机制的主要原因：在宿主细胞内产生如超氧歧化酶等分解酶，分解细胞内具有氧化杀菌作用的物质；还可以通过耐高温基因、胞内生存繁殖基因等基因的表达产物调节、适应、耐受各种不利于生存繁殖的因素。布鲁菌的重要毒力结构因子：脂多糖复合物（lipopolysaccharidecomplex,LPS）及外膜蛋白（outermembraneprotein,OMP）。近年来，对布鲁菌的毒力相关基因的研究逐渐揭示了布鲁菌毒力物质基础，目前已研究阐明的有：四型分泌系统毒力调节基因，表达产物能有效阻止吞噬细胞内吞噬小体与溶酶体的融合作用；压力反应蛋白基因，是与布鲁菌耐受不利生存环境密切相关的毒力基因；亚铁原卟啉合成酶基因，不仅是毒力基因，还参与病情转慢性型[1,2,12]。1.2.8.2感染机制布鲁菌病是一种传染-变态反应性疾病，在感染疾病过程中机体会出现全身网状内皮系统组织增生，常伴有菌血症、毒血症及血液循环系统、免疫系统、泌尿生殖系统、神经组织和运动器官的损伤，其中尤以关节损伤最为明显[14]。布鲁菌可通过呼吸道、消化道，甚至完整的皮肤黏膜侵入感染宿主[15]，侵入宿主后迅速侵入最近的淋巴结，随后被巨噬细胞所吞噬，但布鲁菌对吞噬细胞的吞噬作用有很强的抵抗 4北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立能力，并能在巨噬细胞内大量增殖，达到一定数量后，进入血液循环，以上过程中，布鲁菌分泌的透明质酸酶、内毒素等刺激机体出现菌血症，表现为持续发热，布鲁菌随血液循环到全身达淋巴结、肝、脾、骨髓和生殖系统后，体温会逐渐消退，当布鲁菌大量繁殖并再次进入血液循环释放毒素时引起又一次发热，临床表现称为“波浪热”，整个过程出现全身乏力、关节疼痛、组织坏死、流产、肝、脾肿大等临床症状及病理变化。与其它胞内寄生菌一样，布鲁菌感染宿主需要粘附、入侵、稳定及机体内传播[18]大的自我保护能力[16,17]。有研究者认为布鲁菌病后期所表现的慢性感染与胞内寄生关系密切，因为胞内寄生逃避了宿主胞外免疫防御的利器：抗体和补体。布鲁菌在巨噬细胞的吞噬小体中能通过快速酸化作用来阻止吞噬小体的溶酶体融合，从而保护自己的生存繁殖，所以吞噬小体是布鲁菌在宿主胞内生存繁殖的小环境[19～22]。布鲁菌对妊娠子宫有极强的适应性，易于在妊娠子宫中生长繁殖。当布鲁菌侵入妊娠子宫后可引起胎盘化脓，甚至出现坏死性病变，造成胎儿发育不良，导致胎儿死亡。死胎对于子宫是一种强烈的异物性刺激，这种应激最终使胎盘失去正常生理机能，引起母畜流产。病变胎盘坏死组织机化，形成肉芽组织，使母体胎盘与胎儿胎盘之间紧密结合，造成流产后胎衣滞留不下。如果子宫长期处于炎症状态或蔓延至卵巢使其出现不可逆病变时，会造成不孕症，该现象常见于羊。愈后母畜的子宫也有可能再次妊娠，但如果其他组织中的布鲁菌再经过血液循环入侵子宫，会引起再次流产。个别机体在被感染后可获得免疫力，至于强度和时间则随个体差异不同[23]。1.3流行病学布鲁菌病影响极大，无论从其受威胁人畜数量、流行地域，还是其危害程度，布鲁菌病都可称为世界重大传染病之一[24]。布鲁菌的易感宿主范围很广，人和多种禽畜及野生动物均可感染，家畜中牛、羊和猪发病较多。传染源是病畜和带菌动物，其中流产母畜最为危险，流产的死胎、胎衣、羊水及阴道分泌物中都存在大量布鲁菌。病畜精液和乳汁中也有布鲁菌存在。本病一年四季均有发生，但是不同动物习性及饲养管理条件不同，导致有的群体发病显现一定的季节性。布鲁菌的流行范围广，目前全世界4/5的国家和地区有人或动物布鲁菌病存在和流行，其中在亚非拉国家最为严重，仅有澳大利亚、新西兰以及北欧少数几个国家没有感染流行[8,25]。全世界约有15亿人受到布鲁菌病的潜在威胁，每年新发人布鲁菌病约有50万人[26,27]。四步。布鲁菌在机体内生存能力极强，可在较短的时间内大量繁殖，这得宜于强 内蒙古农业大学硕士学位论文5布鲁菌病对人类健康及畜牧业发展具有很大危害，大多数国家和地区制订并执行了布鲁菌病的彻底清除计划，一度使世界布鲁菌病疫情得到有效控制，甚至一些发达国家彻底消除了布鲁菌病[28,29]，但从20世纪80年代后期开始，布鲁菌病疫情在世界部分国家和地区有所回升，其中亚洲布鲁菌疫情最为严重。布鲁菌病在我国流行已久，建国前，由于社会、科技等原因我国对人畜布鲁菌病疫情几乎一无所知[30]。新中国成立之后，布鲁菌病的防制工作受到相关部门的高度重视，开始对人畜布鲁菌病进行有组织有计划地调查和研究，并采取综合性的防治措施。从1952～1990年，通过流行病学调查了20多种家畜及野生动物，布鲁菌病总感染率达17.3%[31]，其中从1952年到1990年，布鲁菌病阳性率下降70多倍，1991年～1998年，布鲁菌病阳性率在0.07%左右[32,33]。结果表明我国布鲁菌病疫情在上世纪80年代至90年代中期得到了十分有效的控制[32,33]。但从1994年之后，布鲁菌病阳性率又呈逐年上升趋势[34]。随着畜牧业的发展，人间布鲁菌病也呈回升势头。从1994年新发病人数为815人，到2005年19664人，2006年20279人，2007年21195人，2008年27767人，2009年35816人，2010年33772人，2011年38151人（中国疾病预防控制中心法定传染病报告），布鲁菌病疫情已非常严峻。另外，布鲁菌病的漏报现象也比较严重，可想我国每年实际患病人数可能更多。1.4临床症状牛羊猪等动物的布鲁菌病多由本型布鲁菌引起，也存在交叉感染与混合感染的现象。各种患病动物临床症状较为相似。未怀孕母畜一般不表现临床症状。成年怀孕母畜感染后，主要临床表现为流产、胎衣滞留等，少数病例出现关节炎。胎盘炎是引起胎衣滞留的主要原因。乳腺和淋巴结也可出现炎症反应，乳腺中的病原菌可经乳汁排出，淋巴结中的病原菌达到一定数量后，又可重复进入子宫和乳腺，引起感染。发生急性感染时，全身多数淋巴结都存在布鲁菌。公畜可出现生殖系统炎症。布鲁菌侵入人体后，常引起波浪热，肌肉-骨骼系统心、血管系统和中枢神经系统等多器官系统的严重并发症。如得不到及时彻底的治疗，常发展成慢性型，造成浑身无力，不孕不育。1.5诊断方法目前，布鲁菌病的诊断方法主要有病原学、免疫学及分子生物学三种。1.5.1病原学诊断病原学诊断一般取被检动物抗凝全血、肝脏、脾脏、分泌物或流产胎儿、胎衣等病料。布鲁菌分离培养常用的培养基有布氏琼脂、肝琼脂、血清葡萄糖琼脂（SDA）、含10%马血清的马丁琼脂、土豆琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） 6北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立等。在以上专用培养基中，至少需要4～5天才能长出菌落。涂片镜检常用的鉴别染色法有柯兹洛夫斯基法、改良Koster氏法、改良Ziehl-Neelsen氏法等。根据所分离菌的性状，A、M、R单因子血清玻片凝集，硫堇、碱性复红抗性等多种生物化学特性对布鲁菌进行种型鉴定[6,7,35]。布鲁菌病病原学诊断可以准确的鉴别出布鲁菌及其生物型，但分菌所需时间周期较长，操作危险性高，且一般实验室不具备资质条件。因其条件要求较高，不利于布鲁菌病的快速诊断和控制，所以不推广使用。1.5.2免疫学诊断常用的布鲁菌病免疫学诊断方法有传统的平板凝集试验（PAT）、试管凝集试验（SAT）、乳环试验（CYT）、补体结合试验（CFT），以及近年来的研究热点酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光偏振试验（FPA）、免疫胶体金检测法。1.5.2.1凝集试验凝集试验的原理是抗原表面脂多糖（S-LPS）O-链与抗体发生凝集，从而判定阴阳性。所有光滑型布鲁菌的脂多糖都含有多糖O-链，而粗糙型布鲁菌的脂多糖缺乏多糖O-链，所以凝集实验的弊端就是无法检测出粗糙型布鲁菌。而且还有能与布鲁菌发生交叉反应的细菌，如耶尔森氏菌O:9，亦有类似的脂多糖O-链结构，会影响凝集结果，造成特异性下降，假阳性升高[37,38]。传统平板凝集试验是最早应用于布鲁菌病检测的方法，许多发达国家已基本停止使用该方法，取代它的是敏感性、特异性更好的虎红平板凝集试验（RBT）、缓冲平板凝集试验（BPAT）和卡片试验，它们都属于缓冲布菌抗原试验（BBATs）[36]，在国际贸易中，指定BBATs为牛、羊、猪种布鲁菌病的筛选试验。试管凝集试验不仅可以判定阴阳性，而且可以定量，在判定反应强度方面比虎红平板凝集试验更精确。我国将试管凝集试验作为布鲁菌病诊断的法定试验。二巯基乙醇试管凝集试验可以区分抗体滴度变化是由人工免疫还是自然感染造成，但只能检测小分子量免疫球蛋白。致敏红细胞凝集试验以动物红细胞为载体，使其与抗原、抗体形成网状复合物，使凝集试验检测的灵敏度进一步提高[39]。1998年徐春厚等[40]选用上诉四种检测方法，对32份牛血清进行了布鲁菌抗体的检测，并对四种方法的检测能力进行了横向比较。结果显示虎红平板凝集试验的阳性检出率达到90%，其余三种方法略低，但是四种方法检测结果的阳性符合率只有50%，该结果表明仅用一种检测方法来判定牛是否感染布鲁菌病会出现假阳性等非特异性结果。 内蒙古农业大学硕士学位论文7此外还有Batra等[41]创造的着色金黄色葡萄球菌协同凝集试验检。马恒之等[42]的葡萄球菌A蛋白（SPA）协同凝集试验，均有较高的敏感性与特异性。1.5.2.2补体结合试验补体只能与抗原抗体复合物结合，不能单独与抗原或抗体进行反应，因此补体结合试验被认为是最为准确的血清学试验技术之一，并得了全世界的广泛应用。补体结合试验是非常重要的布鲁菌病的诊断方法，在国际贸易中，被指定为牛、羊、绵羊副睾种布鲁菌病的诊断试验[43]。因为猪的补体会干扰豚鼠补体，而影响试验的敏感性，因此该试验不适用于猪布鲁菌病的检测[44，45]。有学者认为CFT步骤复杂，结果判定具有主观性，且不能区分人工疫苗免疫与自然感染，实验条件比较苛刻，很难进行现场检测，不适宜向基层推广[46]，而Searson[47]建立的改良微量补体结合试验，比传统CFT具有更好的敏感性与特异性，且快速、价廉。1.5.2.3酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验产生并发展于上世纪70年代，是一个新兴生物技术。1976年Carlsson等人首次将ELISA应用于牛布鲁菌病抗体的检测，并发现该方法的敏感性比试管凝集试验高10～100倍。之后，各国研究人员相继应用ELISA对人和动物进行了布鲁菌病抗体检测，结果均表明较凝集试验和补体结合试验，ELISA的敏感性和特异性更高。ELISA方法不但可用于血清的诊断，还可用于乳汁检测[48]。在国际贸易中，ELISA已被指定为牛种和猪种布鲁菌的检测试验。羊种布鲁菌的ELISA诊断方法也研究试用中。目前较为常用的ELISA主要包括间接ELISA（iELISA）、竞争ELISA（cELISA）、双抗原夹心ELISA（DAgSELISA）和斑点ELISA（Dot-ELISA）等。ELISA的敏感性和特异性明显要高于传统布鲁菌病诊断方法，并可以大批量检样。它既可以作为筛选试验，又可以作为确证试验。今后必将成为布鲁菌病诊断与监测的重要工具。1.5.2.4其他免疫学诊断乳环试验是监测奶牛布鲁菌病的主要方法[49]。该方法操作快速、简便，更重要的是避免了采血造成的不便，减少了奶牛身体的应激反应，不影响奶牛的产奶量。可替代虎红平板凝集试验和试管凝集试验成为牛场布鲁菌病检疫的重要方法。但该方法假阳性率较高，且奶羊变质会影响检测结果，所以高温季节也不适用。荧光偏振法也是检测布鲁菌的一种方法。GallD等[50]用荧光偏振法检测牛种布鲁菌，并与其它传统血清学检测方法进行了比较研究，结果发现荧光偏振法的敏感度和特异性分别为92.1%和99.4%，均高于其它实验结果。与ELISA比较，荧光偏振法在保证高敏感性与特异性的前提下，检测费用成本低，没有洗板步骤，孵育时间大大减少。 8北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立1998年ZagoskinaTiu等[51]研究并建立检测布鲁菌抗原的免疫胶体金试纸，应用该试纸对Irkutsk地区的布鲁菌病疑似病人和病畜进行了检测，证明其敏感性和特异性很好，最低可检测1pg/ml或135CFU/ml浓度细菌。免疫胶体金技术具有良好的特异性、敏感性和稳定性，操作方便、快捷、经济。检测布鲁菌抗原的免疫胶体金试纸条已在许多国家投入使用。1.5.3分子生物学诊断血清学方法是布病最常用的检测方法，其种类繁多，各具优劣凭，但还没有一种方法能够单独适用，都需要相互配合以最终确诊。与血清学方法比较，分子生物学方法具有良好的敏感性和特异性，已广泛应用于布鲁菌病的快速诊断及布鲁菌分型、遗传关系、进化特征、毒力、宿主选择等方面的深入研究。目前常用的分子生物学方法主要包括DNA同源性测定，聚合酶链式反应等。1.5.3.1DNA同源性研究细菌DNA同源性的测定包括G+Cmol%含量及DNA-DNA分子杂交率的测定。国外一些实验室已将G+Cmol%含量和DNA杂交测定作为细菌鉴定的基本方法。国内外研究者对布鲁菌6个生物型DNA的G+Cmol%的测定结果，均处于55～59%之间，种间DNA的G+Cmol%含量波动较小[6]。Verger等人利用DNA分子杂交研究表明布鲁菌种间同源性大于90%，属高度同源。该方法对鉴定表型发生突变的布鲁菌分离株尤为重要。我国科研工作者也对该方法进行验证，结果与文献报道一致，进一步证明布鲁菌DNA同源性研究，对该菌的鉴定和分型具有极为重要的意义。1.5.3.2聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR），由Mullis等人于1985年正式提出，此后，该技术发展成多种PCR技术，在生物学和医学中得到非常广泛的应用，已成为重要的疾病检测技术之一。普通PCR：1990年Fekete等[52]首次成功应用PCR技术检测布杆菌病。Baily和Krahn等[53,54]于1992年将PCR方法应用于布鲁菌属的鉴定，该实验根据编码布鲁菌外膜蛋白31（OMP31）的基因BCSP31设计一对特异性引物B4、B5，扩增片段长度为223bp，最低检出量为1pg的DNA模版。随后经多种应用实验证明该PCR方法具有很好的特异性、敏感性、重复性与稳定性，可在属的水平上鉴定布鲁菌。AMOS-PCR：1993年Halling等人[55]报道所有的布鲁菌基因中都含有几个保守的重复插入序列，如IS711（或IS6501）。插入序列的分布是布鲁菌DNA多态性的 内蒙古农业大学硕士学位论文9一个重要原因。布鲁菌插入序列IS711在染色体中的拷贝数和插入位点非常稳定，一般在牛种、猪种和犬种中重复6～8次，羊种中重复7～10次，在绵羊附睾种中重复超过28次。1994年，Bricker和Halling[56]基于布鲁菌插入序列IS711建立AbortusMelitensisOvisSuis-PCR（AMOS-PCR）技术。该反应共设计9条引物，基于1条限制在IS711序列中的公用引物与另8条不同种引物相互配对扩增序列，结果：B.abortusbv.1、2、4，可扩增出498bpDNA条带；B.melitensisbv.1、2、3，可扩增出731bpDNA条带；B.suisbv.1，可扩增出285bpDNA条带；B.ovis，可扩增出976bpDNA条带。该方法不仅能区分4个布鲁菌种，并且对某些种的不同生物型也进行了区分，开创了利用PCR技术对布鲁菌分型的初步研究。随着布鲁菌基因序列的深入研究，Bricker和Halling于1995年[57]在AMOS-PCR的基础上增加了两种常用疫苗株S19和RB51的特异性引物，对人工免疫S19和RB51与自然感染病例进行鉴别诊断。2003年Bricker等人[58]又在原有研究基础上改进AMOS-PCR，建立具有鉴别功能的Bass(brucellaabortusspecies-specific)PCR，该方法对牛种布鲁菌具有重要的鉴别诊断意义。随后Ocampo等[59]通过以IS711插入序列为探针的Southern印迹杂交（Southernblot）和AMOS-ERY-PCR发现，牛3型除有牛3a生物型外，还有牛3b型，进一步证明该方法在鉴别诊断中的重大意义。2008年钟旗等[60]进一步完善AMOS-PCR诊断方法，完善后的方法可对犬种布鲁菌进行鉴定。Bruce-ladderPCR及研究进展：布鲁菌各种基因序列都存在特异性缺失，B.abortus中omp31基因中缺失一个长为25kbDNA片段；B.ovis中omp25、wboA以及wboB基因缺失一段长15kb的基因；B.canis染色体I中一段长976bp基因的缺失；B.neotomae染色体II中一段长2.2kb基因的缺失；B.suis有一段长2.6kb的基因在B.abortus和B.melitens中不存在[61、62]。在次基础上2006年DavidGY等人[63]建立了一种多重PCR方法(Bruce-ladderPCR)，仅用一步就可鉴别布鲁菌，包括疫苗株S19、RB51和Rev.1及海洋株。我国研究者崔步云等人也根据此原理建立了一个5重PCR体系，可鉴定牛、羊、猪、犬、绵羊附睾和沙林鼠布鲁菌。世界动物卫生组织在2009年将Bruce-ladderPCR法编入了OIE手册，并作为鉴定布鲁菌的诊断方法，用该方法可以布鉴定鲁菌6个种型、疫苗株(S19、RB51、Rev1)及近年新发现的鲸和鳍布鲁菌。但MarkS.Koylass[64]及我国的姜海等人[65]在应用该方法时发现某些犬种布鲁菌会被错误地诊断为猪种布鲁菌。VirB8PCR：布鲁菌四型分泌系统(TypeIVsecretionsystems，TFSS)是布鲁菌重要致病因子，它由十二个蛋白VirB1～VirB12组成，其中VirB8是一种早期分泌蛋白，也是TypeIV的必备组成成分，可在感染后4h检测到VirB8抗体。RouotB等人建立VirB8-PCR法，扩增一段716bp片段，可以用于布鲁菌病的早期诊断[66]。荧光实时定量PCR（Real-timePCR）[67]：在PCR反应中加入了荧光标记探针， 10北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立通过荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，该技术的产生使PCR实现了从定性到定量的巨大飞跃，不仅提高了特异性，还有效的解决了PCR的污染问题。2000年RRedkar等人[68]应用real-timePCR检测牛、羊、猪种布鲁菌，通过试验证明荧光定量PCR是一种快速，敏感，特异的检测方法。2004年WilliamSProbert等人[69,70,71]根据布鲁菌BCSP31基因进行布鲁菌属引物的设计，再根据布鲁菌IS711插入序列下游的两个不同基因ALKB和BMEI1162分别设计牛、羊种布鲁菌的引物，建立多重real-timePCR方法鉴别布鲁菌属以及牛、羊种布鲁菌的分型，并进行了实际应用。实际应用：l999年SerpeL等人[72]建立了一步法快速PCR检测牛乳和软质奶酪中的布鲁菌。2000年SreevatsanS等人[73]用布鲁菌和结核菌多重PCR对感染牛的乳汁、鼻分泌物检测。这些方法不用分离培养细菌，简化了检测程序，降低了实验人员受感染的危险性。1.6布鲁菌病疫苗布鲁菌属于胞内寄生菌，大多抗生素无法对其产生抑制杀灭作用，而且容易产生耐药性。要想彻底控制和消灭布鲁菌病，有效的疫苗免疫接种才是关键所在。我国采取预防为主的方针，生产中常用的疫苗如下：1.6.1弱毒苗目前，在布鲁菌病的预防中，国内外大多使用弱毒苗。弱毒苗免疫保护效率高，持续期长，生产成本低。但也有缺点，如毒性不稳定的可能对人存在致病性；有些疫苗会引起流产，限制了在孕期动物的免疫接种；动物免疫后干扰血清学诊断结果，难以与自然感染鉴别；有种属限制，一种苗只适用于一种畜[74]等，并且至今仍没有一种适用于人的安全可靠的疫苗。1.6.1.1牛型19号（S19）弱毒活菌苗S19弱毒苗是由美国人Buck从牛奶中分离到的流产布鲁菌自然减毒制成，于1958年首次使用，因其稳定的弱毒性和持久的免疫效果，被多数国家广泛应用[75,76]，当然也有缺点，如可能引起局部感染；影响产奶量；S型菌，能干扰血清学诊断；因其可能导致孕畜流产，所以孕期禁用。该疫苗主要应用于牛，对绵羊也有较好的保护性，对山羊效果不好，对猪则没有效果[7]。1.6.1.2羊型ReV.I弱毒活菌苗ReV.I弱毒苗由返祖1号菌株制成，是在含链霉素的培养基上连续培养强毒马尔他布鲁菌，所获得的变种必须依赖链霉素才能生长，再将其培养于普通琼脂培养 内蒙古农业大学硕士学位论文11基上，最终获得的弱毒变种又可不依赖链霉素生长。该疫苗对绵羊和山羊具有很好的免疫效果，保护率高达88%左右，对牛也有一定免疫保护。但此菌株毒力较强，可发生被免疫动物带菌、排菌，对人产生危害。除此之外，也有导致流产，干扰血清学诊断的缺陷[77,78]。1.6.1.3粗糙型减毒活菌苗RB511991年，Schurig等人[79]发现了一株抗利福平的突变粗糙型牛布鲁菌2308并命名为RB51，通过经各种动物体或在体外传代均未出现变异。它对牛的免疫保护效果与S19相当，免疫动物后可在很短的时间内得到清除，并且不会引起孕畜流产。值得注意的是RB51对绵羊没有免疫保护作用，其机理尚不清楚[80]。由于RB51属R型菌，故不影响血清学诊断结果。1.6.1.4羊型5号（M5）弱毒活菌苗M5弱毒苗是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所将马尔他布鲁菌生物1型H28强毒菌株在鸡体内连续传代至毒力减弱制成，自70年代后在国内大规模投入生产应用[7]。主要用于绵羊和山羊的免疫保护，对牛和鹿有一定保护，对猪没有免疫效果。缺点是仅有一年左右的免疫期；导致孕畜流产[81]；毒力不稳定，接种后可能变异增强；气雾免疫应用，可引起操作人员较严重的不良反应[82]。M5～90株是在保持M5株原有的免疫原性的基础上，使其弱毒性进一步稳定而得到的疫苗株。1.6.1.5猪型2号（S2）弱毒活菌苗中国兽药监察所从猪胚中分离得到猪种布鲁菌减毒后成为S2弱毒苗。可经口服或注射用于猪、牛、羊的免疫，毒力弱且稳定，不会引起孕畜流产。因其安全可靠，使用方便，已推广到农牧区广泛使用。1.6.1.6牛种布鲁氏菌104M1950年苏联人Вечщиова从牛流产胎儿中分离到M和T株布鲁菌，试验证明M株免疫力强、毒力弱且稳定，被我国引入应用于生产。1964年我国采用皮肤划痕法将104M用于人布鲁菌病的免疫，免疫期可持续一年，迄今仍在沿用[83]。1.6.2灭活疫苗灭活疫苗对人畜安全，但存在较多问题限制了它的推广使用，灭活过程易造成中抗原表位的丢失，使其免疫保护持续时间缩短，保护力下降；接种可引起注射部 12北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立位的化脓感染；造价高用量大[84]等，依然没有解决免疫后血清学反应呈阳性的问题。现有的灭活苗有牛种45/20灭活疫苗和羊种53H38灭活疫苗，但已很少使用。1.6.3新型疫苗在布鲁菌病的防治中，弱毒苗一直都主力军，做出了巨大的贡献，但也带来了一些隐患，如干扰诊断从而影响本病的流行病学调查及防治；因接种免疫而导致人畜感染；免疫后产生的副作用，流产、生产能力下降的等。因此继续研究开发新型布鲁菌疫苗对于本病的控制甚至彻底清除都将具有重大意义。研究最多的是组分苗和基因工程苗。组分苗：加以佐剂的免疫原，使用后可产生应有的保护效果，产生较少副作用。但由于生产工艺、造价、免疫期等因素，很难推广。最重要的是因其组分少，难产生综合免疫，还有待进一步研究。基因工程疫苗：删除掉病原毒力相关基因后使其病毒变成不带毒力相关基因的缺失苗；或将编码病原保护性抗原的基因片段克隆入表达载体，用以转染细胞或真核及原核细胞微生物后得到的产物。基因工程苗用很好的应用前景，但其诱导的保护性免疫效果不够好，不能很好保护被免疫者，也不能完全取代弱毒苗和死苗。大多基因工程苗仅有一个免疫分子，免疫效果始终达不到有完整成分的弱毒苗和死苗，所以非常有必要研究具有两种以上保护性抗原的多价疫苗，所表达出的融合蛋白可激发机体免疫系统，也可以使用联合免疫。1.7本研究的目的意义布鲁菌病不仅给全世界畜牧业造成了严重的危害，还给动物源性食品带来了安全隐患，使人类健康受到严重威胁。在我国一度得到很好控制的布鲁菌病在近些年随着畜牧业的飞速发展也开始死灰复燃，每年新报告动物及人感染数据都在不断攀升，由此带来的经济损失难以统计。本研究采样地是我国重要的畜牧业基地，随着改革开放的深入发展，在中国奶业企业的带动下奶牛业取得空前发展，但近年来国内布鲁菌病的强势反弹对正在快速发展的畜牧业带来不稳定因素，影响奶牛业的持续健康发展。了解畜间布鲁菌感染情况，控制布鲁菌病的流行已成为最迫切要解决的问题之一。本研究利用虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）和间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）方法，随机对该地区部分牧场及散养牛总计950头进行了布鲁菌病血清流行病学调查，同时对上述三种方法的检测能力进行了横向比较；根据GenBank已发表布鲁菌全基因序列设计合成三对引物，建立了快速检测布鲁菌属及牛、羊种布鲁菌的鉴别性多重PCR诊断方法，并进行了初步应用性试验，可以用于乳样、阴道及粪便棉拭，减少了采血造成的应激，在不影响动物生产性能的情况下做出快速准确的诊断。 内蒙古农业大学硕士学位论文13本研究为该地区制定更有效的布鲁菌病防控措施提供可靠的参考数据，所建立方法具有潜在应用价值。22.1实验一：北方某地区牛布鲁菌病血清学调查材料2.1.1被检血清北方某地区未免疫牛血清，共计950份，其中牧场一148份，牧场二71份，牧场三92份，牧场四285份，散养牛血清354份。2.1.2主要试剂布鲁菌病虎红平板凝集试验抗原、布鲁菌病试管凝集试验抗原、阴阳性血清购自中国兽医药品监察所。牛布鲁菌抗体检测I-ELISA试剂盒，购自北京爱德士元享生物科技有限公司。2.1.3主要设备BioTekELx800酶标仪、Eppendorf多孔道移液器、RAININ移液器一套，由内蒙古农业大学兽医学院动物传染病教研室提供。2.22.2.1血清学检测被检血清分离及保存用无抗凝剂采血管颈静脉采血（采血后切勿剧烈晃动，以免溶血），置于4℃过夜，血清析出较少时可以低转速离心。血清-20℃冻存，备用。2.2.2虎红平板凝集试验（RBT）利用布鲁菌病虎红平板凝集试验抗原对牧场1、2、3及散养牛群665份血清进行布鲁菌血清抗体的检测，步骤如下：1)将诊断抗原和被检血清提前回温至室温。2)在洁净透明玻璃板上画格，每格至少4cm2，按被检血清编号。3)每格正中滴加30µL布鲁菌病虎红平板凝集试验抗原，再按编号滴加30µL被检血清，用枪头混匀，涂开至硬币大小。4)设置阴阳性对照，方法同上。5)轻微摇动，在对照成立的前提下判定结果：4min内出现肉眼可见凝集颗粒判定为阳性（+），依然呈粉红色，无凝集颗粒出现判定为阴性（-）。 142.2.3北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立试管凝集试验（SAT）利用布鲁菌病试管凝集试验抗原对牧场1、2、3及散养牛群665份血清进行布鲁菌血清抗体的检测，步骤如下：1)配制0.5%石炭酸生理盐水（稀释液），高压灭菌备用。2)用稀释液将布鲁菌病试管凝集试验抗原做1：20稀释，现配先用。3)每份被检血清需要4支10mL干净试管，第1管按被检血清编号。4)第1管中加入2.4mL稀释液，第2、3、4管均加入0.5mL稀释液。5)吸取0.1mL被检血清加入1号管，混匀，弃去1.5mL，从剩余的1mL中抽取0.5mL加入第2管，混匀，抽取0.5mL加入第3管，混匀，抽取0.5mL加入第4管，弃去0.5mL。稀释后，第1～4管的血清稀释度为1:25、1:50、1:100和1:200。6)所有管中均加入0.5mL已稀释好的布鲁菌病试管凝集试验抗原，振荡混匀。此时第1～4管的血清稀释度为1:50、1:100、1:200和1:400。7)阴阳性血清对照方法同上。8)置于37℃温箱24h后，观察结果。++++，完全凝集，100%下沉，上层液体彻底清亮。+++，几乎完全凝集，上层液体75%清亮。++，显著凝集，液体50%清亮。+，有少量凝集物沉淀，液体25%清亮。－，无凝集物沉淀，液体依旧均匀混浊。出现“+”判定为可疑，出现“++”及以上判定为阳性。2.2.4间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）利用间接酶联免疫吸附试验对牧场1、2、3、4及散养牛群950份血清进行布鲁菌血清抗体检测，操作步骤按牛布鲁菌抗体检测I-ELISA试剂盒使用说明书进行：1)所有试剂在使用前回温至室温（18～25℃），浓缩洗涤液按1：10稀释备用。2)每个孔中均加入90µL稀释好的洗涤液。3)依次在孔中加入阴阳性对照（重复两孔）和未稀释的血清各10µL。对照和样品的最终稀释度为1:10。4)轻轻振动微量反应板，使每个孔的内容物混合均匀。5)用密封膜将微量反应板封严，置于37℃孵育60min。6)充分甩去个孔中的液体，向每个孔中加入300µL稀释好的洗涤液，共洗三次。充分甩去个孔中的液体，然后在吸水纸上拍干。7)每孔中均加入酶标抗体100µL。8)加封后，将微量反应板置于37℃孵育60min。 内蒙古农业大学硕士学位论文159)重复步骤6。10)每孔均加入100µL的底物（TMB）。11)在室温下孵育15min。12)向每孔中加入100µL的终止液终止反应，注意终止液加入顺序应与底物加入顺序相同，以保证反应时间一致。13)用酶标仪读取450nm波长处吸光结果。阳性对照的OD值应不大于2.0，阴性对照的OD值应不低于0.5，阳性对照和阴性对照的差异应至少为0.3，试验方有效。计算方法：通过减去阴性对照孔的OD值，对阳性对照孔的OD值和样品空的OD值进行校正，并根据以下公式计算结果。值（%）=（样品OD值-阴性OD值）/（阳性OD值-阴性OD值）×100%结果判断：2.3结果值判定<80%阴性≥80%阳性通过对采自北方某地区牧场和散养牛的950份血清进行布鲁菌病血清抗体检测：RBT检出阳性血清105份，阳性率为15.8%。其中牧场一检出阳性血清37份，阳性率为25.0%；牧场二牛血清未检出阳性血清，阳性率为0%；牧场三检出阳性血清27份，阳性率为29.3%；散养奶牛检出阳性血清41份，阳性率为11.6%。SAT检出阳性血清128份，阳性率为19.2%。其中牧场一检出阳性血清32份，阳性率为21.6%；牧场二牛血清未检出阳性血清，阳性率为0%；牧场三检出阳性血清26份，阳性率为28.3%；散养奶牛检出阳性血清70份，阳性率为19.8%。I-ELISA检出阳性血清262份，阳性率为27.6%。其中牧场一检出阳性血清64份，阳性率为43.2%；牧场二牛血清未检出阳性血清，阳性率为0%；牧场三检出阳性血清46份，阳性率为50.0%；牧场四检出阳性血清13份，阳性率为4.6%；散养奶牛检出阳性血清139份，阳性率为39.3%。结果见表1。 16北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立表1北方某地区牛布鲁菌病血清学检测结果Fig.1AserologicaltestresultsofbrucellosisdiseaseinaregionofnorthChina牧场动物（未免疫）检测方法检测数阳性数阳性率(%)RBT3725.0一奶牛SAT1483221.6I-ELISARBT64043.20二种公牛SAT7100I-ELISARBT027029.3三奶牛SAT922628.3I-ELISA4650.0四奶牛I-ELISA285134.6RBT4111.6散养奶牛SAT3547019.8I-ELISA13939.3RBT66510515.8总计SATI-ELISA66595012826219.227.62.4讨论本实验对北方某地区3个规模化奶牛场、1个种牛场和一些小型奶牛散养户的950头牛血清样品进行了布鲁菌病流行病学调查，结果显示种牛场未检出布鲁菌阳性牛，其他牛场及散养户牛群均检出布鲁菌病血清抗体阳性牛，且阳性率较高，证明该地区牛群布鲁菌病感染情况较严重。从I-ELISA检测结果可看出，在不同的奶牛群中，布鲁菌病感染率分布不均衡。牧场一、牧场三和散养牛布鲁菌病血清抗体阳性率较高；牧场四布鲁菌病血清抗体阳性率低；牧场二布鲁菌病血清抗体阳性率为零。本次所检牛血清来源不同，牧场一、三、四为规模化大型奶牛场，牧场二为种牛场，散养奶牛采自该地区郊区农村个体养殖户，抽检范围较全面。其中牧场一和牧场三位于该地区近郊，且离自然村落及公路较近，可能受当地的环境和条件限制，其管理较松散，牛群流动性较大，检疫和消毒制度不完善。这可能给布鲁菌在牛群中的感染传播创造较好的条件。牧场四属于某大型企业下属牧场，位置较为偏远，管理较严格，平时采取严格的疾病检疫和自养自繁制度；对环境进行定期消毒；对 内蒙古农业大学硕士学位论文17病畜采取非常严格的淘汰扑杀措施。管理制度及牧场地理位置对牧场一、三、四的布鲁菌病防制起到了关键作用。牧场二是种牛场，牛群主要用于牛冷冻精液的制造及胚胎移植，因其特殊用途，该牧场的饲养管理非常严格。选种和引进种牛时进行严格的检疫；平时对牛群定期进行布鲁菌疫情监测，果断处理检出布鲁菌病阳性或可疑牛；对流产胎儿、排泄物及可能污染的物品及时采取进行无害化处理措施；对畜舍及奶牛活动场所进行定期消毒，及时消灭在周围环境中可能存在的病原微生物，主动避免畜群的感染，布鲁菌病得到完全彻底的控制。散养奶牛为该地区农村个体奶户奶牛，畜主对布鲁菌病的认识较差，奶站的管理较随意，奶牛容易受到病原菌的感染。基于以上饲养管理及地理位置上的差距，我认为牛布鲁菌病感染率分布不均衡可能与饲养管理制度、疫情监测措施有直接的联系。三种方法比较分析，从检测结果来看I－ELISA检测阳性率要明显高于其他两种方法，且RBT和SAT检出的阳性血清95%为I－ELISA阳性，符合率较高，说明I－ELISA在牛布鲁菌病血清学检测中有很好的特异性与敏感性，敏感性远高于RBT和SAT。国内外研究结果表明，RBT和SAT的敏感性和特异性较低，RBT敏感性是81.2%、特异性为86.2%，SAT敏感性是95.4%，特异性可达到97.7%，I-ELISA的敏感性和特异性都高达99%。众所周知，RBT和SAT是检测布鲁菌病的常用血清学方法，也是我国检测布鲁菌病的国家标准试验方法，但从本次实验结果分析，我国以RBT和SAT为主导的布鲁菌病检疫工作可能存在很多缺点，可能影响着动物群检疫净化工作效果。鉴于目前国内人畜间布鲁菌病疫情开始上升和反弹形势，建议我国在动物移动检疫和执行布鲁菌病检疫净化根除措施时采用ELISA试验作为我国的检测布鲁菌病标准试验方法。33.1实验二：多重PCR方法的建立材料3.1.1菌株疫苗A19（新疆天康畜牧生物技术股份有限公司）、疫苗S2（青海生物药品厂）、疫苗株M5，均由内蒙古自治区动物疫病预防与控制中心提供。7株阴性对照菌株：禽巴氏杆菌C48-1、葡萄球菌166、葡萄球菌26001、大肠杆菌650、大肠杆菌O78、马流产沙门氏菌、羊链球菌，均由内蒙古农业大学兽医学院动物传染病教研室与兽医微生物教研室提供。3.1.2临床样品牛乳样19份，阴道及粪便棉拭16份，采集自布鲁菌病血清学RBT、SAT、I-ELISA检测结果均为阳性的奶牛。 183.1.3北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立主要实验仪器EppendorfMastercyclerPCR仪；EppendorfMastercyclergradientPCR仪；EppendorfCentrifuge5417R低温高速离心机；上海安亭TGL-16C台式离心机；北京长风HW·SY11-K电热恒温水浴锅；SYNGENEG：BOX凝胶成像仪；BAYGENEBG-Power600i水平电泳仪；上海博迅SW-CJ-2FD超净工作台；ThermoMSC-ADVANTAGE生物安全柜；BECKMANCOULTERDU800紫外分光光度计；QilinbeierVORTEX-5涡旋震荡器；RAININ移液器一套等。以上设备均由内蒙古农业大学兽医学院动物传染病教研室提供。3.1.4主要试剂细菌DNA基因组提取试剂盒(离心柱型）购自北京天根生化有限公司。PCR产物纯化试剂盒(离心柱型）购自北京天根生化有限公司。TransStartTaqDNAPolymerase，DNAMarker2000购自北京全式金生物技术有限公司。琼脂糖，购自invitrogen公司。3.2方法3.2.1引物的设计与合成根据GenBank已发表的布鲁菌序列：BCSP31和IS711基因，设计特异性布鲁菌属引物及特异性牛、羊种布鲁菌引物，预计扩增大小分别为222bp、615bp和932bp。引物序列如下：布鲁菌属特异性引物：上游引物F1：5'-CAGACCTGAAAGGCAAGCG-3'；下游引物R1：5'-GATATTGGCAACCGAGCCA-3'。牛、羊种布鲁菌特异性引物：牛上游引物F2：5'-ATCAGGACAAGGACGAACG-3'；羊上游引物F3：5'-GATAATCATCCACCACCTTG-3'；公用下游引物R2：5'-GCTGCGAATAAAGCCAAC-3'。以上引物由华大基因合成。3.2.2核酸提取布鲁菌弱毒疫苗经高温灭活处理后，用生理盐水稀释至1亿菌/mL备用；阴性对照菌株从培养基上洗脱后取1mL灭活备用；乳样煮沸灭菌，棉拭样品经高温处理后用生理盐水浸泡洗涤，取1mL备用。 内蒙古农业大学硕士学位论文19细菌核酸的提取按TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型）说明书进行，步骤如下：1)取处理过的样品1mL，10000rpm离心1min，弃上清，留沉淀。2)向沉淀中加200µL缓冲液，用振荡器振荡至沉淀悬浮。3)再加20µL蛋白酶K，颠倒混匀。4)加220µL缓冲液，轻微振荡，70℃水浴10min，至溶液清亮，简短离心。5)加20µL无水乙醇，充分混匀，简短离心。6)将上步所得溶液加入吸附柱，置于收集管，12000rpm离心40sec，弃废液。7)加500µL缓冲液，12000rpm离心40sec，弃废液。8)加700µL漂洗液，12000rpm离心30sec，弃废液。9)重复上步。10)空离2min，弃废液。彻底晾干吸附膜。11)将吸附柱放入灭菌1.5mL离心管，悬空向吸附膜中间加50～200µL(由样品菌量多少决定）洗脱液，静置数分钟，12000rpm离心2min，将吸附膜上的DNA完全洗脱。所得DNA-20℃保存备用。3.2.3引物特异性验证用布鲁菌属通用引物扩增牛（A19）、羊（M5）、猪（S2）种布鲁菌的DNA，用牛种布鲁菌引物扩增牛（A19）种布鲁菌基因组DNA，用羊种布鲁菌引物扩增羊（M5）种布鲁菌基因组DNA，观察所扩增PCR产物是否符合预期。反应步骤及条件按照Taq酶说明书设定，对PCR退火温度和反应循环数等进行适当调整。PCR反应体系（50µL）如下：引物F、RTaq酶dNTPs（2.5mMg）10×PCRBuffer模板DNAddH2O各2µL(10pmol/µL)1µL4µL5µL2µL34µL 20北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立PCR反应条件：预变性变性退火延伸循环数延伸95℃8min，94℃55sec，58℃55sec，72℃80sec，3272℃8min，反应结束每个反应各取5µLPCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳并拍照。3.2.4引物交叉特异性鉴定以牛种布鲁菌的引物扩增牛（A19）、羊（M5）、猪（S2）种布鲁菌的基因组DNA，观察牛种布鲁菌引物是否仅特异扩增牛（A19）种布鲁菌基因。同样，用羊种布鲁菌引物扩增牛（A19）、羊（M5）、猪（S2）种布鲁菌的基因组DNA，观察羊种布鲁菌的引物是否仅特异扩增羊（M5）种布鲁菌基因。PCR反应体系及基本步骤同3.2.3，电泳检测。3.2.5PCR产物纯化测序鉴定PCR产物的纯化按TIANGENDNA纯化回收试剂盒(离心柱型）说明进行，步骤如下：1)向待纯化PCR产物中加入相同体积的溶液PC，并充分混匀。2)将步骤一所得溶液加入吸附柱，将吸附柱放入收集管，室温放置2min，12000rpm离心1min，弃掉废液。3)向吸附柱中加入600µL漂洗液，12000rpm离心1min，弃掉废液。4)重复步骤3。5)12000rpm空离2min，尽量将吸附膜晾干。6)将吸附柱放入灭菌1.5mL离心管，悬空向吸附膜中间加50µL洗脱液，放置2min后，12000rpm离心2min，将吸附膜上的DNA完全洗脱。将纯化后的PCR产物送invitrogen公司测序，并与已知序列进行同源性比较，对扩增序列来源进行分子生物学鉴定。3.2.6多重PCR反应条件优化分别对Taq酶、PCRBuffer和dNTP的用量，引物浓度配比，PCR反应的退火温度及循环数进行优化，确定最佳反应条件。优化项目及范围见表2。 内蒙古农业大学硕士学位论文21表2多重PCR反应条件优化项目及范围Fig.2Multi-PCRreactionconditionoptimizationitemsandrange优化项目优化范围Taq酶（µL）0.5～1.5Buffer（µL）3～7dNTP（µL）3～5引物浓度配比0.5～1.5退火温度（℃）50～60循环次数25～403.2.73.2.7.1多重PCR方法验证特异性用所建立的多重PCR方法对7株阴性对照菌（禽巴氏杆菌C48-1、葡萄球菌166、葡萄球菌26001、大肠杆菌650、大肠杆菌O78、马流产沙门氏菌）的核酸进行PCR扩增检测该方法的不同细菌种间特异性。反应结束后，各取5µLPCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检查。3.2.7.2敏感性分别将牛（A19）种和羊（M5）种布鲁菌基因组DNA提取物浓度调整至10ng/µL左右（A19DNA浓度为17ng/µL，M5DNA浓度为9ng/µL），连续10倍稀释至1pg/µL水平。对单独模板及混合模版进行浓度梯度扩增，以出现目的条带的最低浓度为该方法的最低检出浓度。反应结束后，各取5µLPCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检查。3.2.7.3重复性用所建立的多重PCR方法连续多次对牛（A19）种和羊（M5）种布鲁菌的基因组DNA进行PCR扩增，检测方法的重复性。反应结束后，各取5µLPCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检查。3.2.8临床样本初步应用用所建立的多重PCR方法对19份牛乳样临床样品、16份阴道及粪便棉拭样品核酸提取物进行PCR扩增，检验该方法的适用性。反应结束后，各取5µLPCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检查。3.33.3.1结果引物特异性结果布鲁菌属通用引物扩增牛（A19）、羊（M5）、猪（S2）种布鲁菌的DNA，结果均能扩增出与预期大小相同的DNA目的片段；牛种布鲁菌引物扩增牛（A19） 22北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立种布鲁菌的基因组DNA，羊种布鲁菌引物扩增羊（M5）种布鲁菌的基因组DNA，结果均能扩增出各自预期大小的DNA目的片段，见图1。图1引物特异性检测结果Fig.1Specificityassayofprimersl3.3.2引物交叉特异性结果用牛种布鲁菌引物扩增牛（A19）、羊（M5）、猪（S2）种布鲁菌的基因组DNA，结果仅从牛种布鲁菌扩增出特异性DNA目的片段；用羊种布鲁菌的引物分别扩增牛（A19）、羊（M5）、猪（S2）种布鲁菌的基因组DNA，结果仅从羊种布鲁菌扩增出特异性DNA目的片段，见图2。 内蒙古农业大学硕士学位论文23图2引物交叉特异性检测结果Fig.2Specificityassayofcrossprimers3.3.3PCR产物测序鉴定结果将布鲁菌属通用引物PCR产物B序列与已知BCSP31序列（参考株HE603359.1和M20404序列）比对结果显示，同源性达到99%，说明目的片段特异，比对结果如下。HE603359157:GCGAACGCGATTTCTGGCGCAGGCGAAAAGGGCGTGCCCGGTCTCGTAGCGACGGCCGTT216M20404B721:GCGAACGCGATTTCCGGCGCAGGCGAAAAGGGCGTGCCGGGTCTCGTCGCGACGGCCGTT7800:------------------------------------------------------------0............................................................HE603359217:TCGTCGAATGGCTCGGTTGCCAATATCAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGGAGTCTGGC276M20404B781:TCGTCGAATGGCTCGGTTGCCAATATCAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGGAGTCCGGC8401:-------TTGGCTCGGTTGCCAATATCAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGGAGTCCGGC53........****************************************************HE603359277:TTTACGCAGTCGGACGTTGCCTATTGGGCCTATAACGGCACCGGCCTTTATGATGGCAAG336M20404B841:TTTACGCAGTCAGACGTTGCCTATTGGGCCTATAACGGCACCGGCCTTTATGATGGCAAG90054:TTTACGCAGTCAGACGTTGCCTATTGGGCCTATAACGGCACCGGCCTTTATGATGGCAAG113***********.************************************************ 24北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立HE603359337:GGCAAGGTGGAAGATTTGCGCCTTCTGGCAACGCTTTACCCGGAAACGATCCATATCGTT396M20404B901:GGCAAGGTGGAAGATTTGCGCCTTCTGGCGACGCTTTACCCGGAAACGATCCATATCGTT960114:GGCAAGGTGGAAGATTTGCGCCTTCTGGCGACGCTTTACCCGGAAACGATCCATATCGTT173*****************************.******************************HE603359397:GCGCGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCGGACCTGAAAGGCAAGCGCGTTTCGCTG456M20404B961:GCGCGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAGGCAAGCGCGTTTCGCTG1020174:GCGCGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAAGGCAAGCGA--------225********************************.*********.*..*..............牛和羊种布鲁菌引物PCR产物Niu和Yang序列如下：NiuYang1:ATCAGGACAAGGACGAACGGAATTTTTCCAATCCCATCGTTTCCGTTTCACTTGGCCTGC6061:CGGCAACGTTTCAGTTTGGCGGAATGAAACGGACGGACCCGATCACCAAATATATCCTGC120121:ACCATGGCGACGTGGTTGTCTGGGGCGGGCCGTCGCGGCTTTTCTATCACGGTATTCTAC180181:CATTGAAGTCTGGCGAGCATGAGCGGCTGGGGCCGTTTCGGCTTAATCTGACCTTCCGAA240241:AGGCGTTCTAGGGCGTGTCTGCATTTAACGTAACCAGATCATAGCGCATGCGAGATGGAC300301:GAAACCCATGAATGCGGTCAATGTTTTCTCGCATCGCAGCGCAATACGACGATAGCGTTT360361:CAACTTGTTAAAAAAGCATTCAATCTGATGGCGTTCCTTGTACAGCCTCCAGTCGATTGT420421:TGGGGCACTGGAACGTGTTGGATTGACCTTGATCTGAGCCGTTGCCTTGAGATCGCTGGC480481:AATGAAGGCCCTTAAGTGATCGGCARSTCATAGGCTGCATCAGCAATGACATGCCCCACA540541:CCCTTCAAGCCGGATAGAAGGCTTGAAGCTTGCGGACAGTCACCATAATGGCCGGGTGTT600601:GGCTTTATTCGCAGC6151:GATAATCATCCACCACCTTGATGACTTTCGGCAAACTTTTGTATTCTTCGTTCATTCGTC6061:TAATCCCCTGAACAAGCCGGGCCTGATCAAAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGATTAAGTTT120121:TTCACCAACAGCTTCGATATCGTTATAAATTTCTTCATAACCCCGGATATGAATCTGAAC180181:CAGCTTATTTGTCTGAACGTTTACTACCTCTCCGGTGCACACAAGCCGCTCATATTCACC240241:GTCTTTGACGTAAATCGCGGTCATGACACCCAAACTTAGCCATGGTGCACCATCGACTAT300301:AAGAAGTTTCTTGTCGTGAATCGCCTTAACAAGCGGCACCCCTAAAAAATCAGGAGTGTT360361:TCGGCTCAGAATAATCCACAGAAGGTAGAGCAGTAATATCCAATAGACGCCATTAACAAT420421:AGCGAGATTGGAATAGCTTACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAAT480481:TATCGCTGTCACTGTTGCAAGTATGGCAGCGAGCGCTCTAGCGTGACGAAGCACTGTCTT540541:TCTGACAATTTCCAGATTCACCCCTAGGGCGTGTCTGCATTCAACGTAACCAGATCATAG600601:CGCATGCGAGATGGACGAAGCCCATGAATGCGGTCAATGTTTTCTCGCATCGCAGCGCAA660661:TACGACGATAGCGTTTCAACTTGTTAAAAAAGCATTCAATCTAATGGCGTTCCTTGTACA720721:GCCTCCAGTCGATTGTTGGGACACTGGAACGTGTTGGATTGGCCTTGGATCTGAGCCGTT780 内蒙古农业大学硕士学位论文25781:GCCTTGAGATCGCTGGCAATGAAGGCCCTTAAGTGATCGGCARSTCATAGGCCGCATCAG840841:CAATGACATGCCCCACACCCTCTAAGCCGGATAGAAGGCTTGAAGCTTGCGGACAGTCAC900901:CATAATGGCCGGGTGTTGGCTTTATTCGCAGC932登录NCBI（美国国立生物技术信息中心）将以上序列进行BLAST（对一条或多条序列在核酸或蛋白序列库中进行比对），分别与牛种及羊种布鲁菌已发表序列同源性达99%，说明目的片段特异。3.3.4多重PCR反应条件优化结果经多次优化检测，最后确定多重PCR最佳反应体系（50µL）为：10×PCRBuffer（含Mg2＋）5µL，dNTP（2.5mmol）4µL，引物（10pmol/uL）F1R1各1.5µL、F21.5µL、F32µL、R24µL，Taq酶1µL，牛、羊种布鲁菌基因组DNA模板各1µL（检测临床样品时根据所提核酸浓度灵活掌握），GCEnhancer5µL。最后确定的应条件：94℃预变性10min；94℃变性50s，56℃退火50s，70℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min，见图3。图3多重PCR优化结果Fig.3OptimizationresultsofmultiplePCR3.3.53.3.5.1多重PCR验证结果特异性结果用所建立的多重PCR方法对7种参照菌（葡萄球菌26001株、大肠杆菌O78、 26北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立马流产沙门氏菌、鸡巴氏杆菌C48、大肠杆菌650株、葡萄球菌166株、羊链球菌）和已知阳性标本的细菌基因组DNA进行PCR扩增，只从阳性对照扩增出特异性条带，见图4。图4多重PCR特异性检测结果Fig.4SpecificityassayofmultiplePCR3.3.5.2敏感性结果多重PCR方法敏感性检测结果显示，其敏感性可达100pg水平，见图5，6，7。 内蒙古农业大学硕士学位论文27图5牛种多重PCR敏感性检测结果Fig.5sensitivityassayofbrucellabovinemultiplePCR图6羊种多重PCR敏感性检测结果Fig.6sensitivityassayofbrucellamelltensismultiplePCR 28北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立图7牛羊种多重PCR敏感性检测结果Fig.7sensitivityassayofbrucellabovineandmelltensismultiplePCR3.3.5.3重复性结果采用建立的多重PCR方法连续多次对牛种布鲁菌A19和羊种布鲁菌M5的单独及混合基因组DNA模板进行检测，均能扩增出正确的目的条带，结果见图8图8多重PCR重复性检测结果Fig.8reproducibilityassayofmultiplePCR 内蒙古农业大学硕士学位论文293.3.6临床样本初步应用结果利用本文所建立的PCR方法，对19份布鲁菌血清抗体虎红平板凝集、试管凝集和I-ELISA血清抗体均为阳性牛的乳样DNA进行扩增。结果19份均为布鲁菌属PCR阳性，其中15份（b，c，e，f，g，h，k～s）为牛种布鲁菌，4份（d，i，j，t）为其他种布鲁菌。乳样检测结果见图9。图9多重PCR检测乳样结果Fig.9milksamplesassayofmultiplePCR利用本文所建立的PCR方法，对16份布鲁菌血清抗体虎红平板凝集、试管凝集和I-ELISA血清抗体均为阳性牛的阴道棉拭DNA进行扩增。结果16份均为布鲁菌属PCR阳性，其中11份（c，g，i～q）为牛种布鲁菌，5份（b，d，e，f，h）为其他种布鲁菌。阴道棉拭检测结果见图10。 30北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立图10多重PCR检测阴道棉拭结果Fig.10vaginalcottonswabassayofmultiplePCR利用本文所建立的PCR方法，对16份布鲁菌血清抗体虎红平板凝集、试管凝集和I-ELISA血清抗体均为阳性牛的粪便棉拭DNA进行扩增。结果16份均为布鲁菌属PCR阳性，其中7份（c，f，i，j，n，o，q）为牛种布鲁菌，9份（b，d，e，g，h，k，l，m，p）为其他种布鲁菌。粪便棉拭检测结果见图11。图11多重PCR检测粪便棉拭结果Fig.11fecescottonswabassayofmultiplePCR 内蒙古农业大学硕士学位论文313.4讨论本地区乳品制造业的飞速发展，带动了周边地区奶牛养殖业的迅猛发展，但由于规划不合理和一些急于求成等原因，使得整个奶牛产业链隐患重重，主要表现在饲养方式的落后，和乳制品企业与奶户关系的不和谐。近年来国家乳制品行业经常曝出原奶的安全问题，严重危协到消费者身体健康，国家有关部委也越来越重视原奶的安全。造成有害原奶的原因主要有两种，有毒害物质和病原菌污染。因布鲁菌不仅对畜牧业造成无可估量的经济损失，而且对人类健康构成巨大威胁，所以其可能对乳品造成的安全问题受到各界广泛关注。传统的布鲁菌检测方法均存在不同程度的缺陷。之前叙述的ELISA虽具有很好的特异性与敏感性，并且可以大批量检样，可是国家尚未统一标准，各厂家试剂质量也各不相同，虽然也有应用于乳汁检测的试剂盒，但大多只能应用于血清的诊断。疫病防控措施的指定需要对该疫病的流行趋势进行定期监测，经常对生产动物进行采血会造成应激，影响生产性能，因此一种可以对乳汁、腔体分泌物、排泄物等样品进行疾病诊断的方法就有很高的实用性与应用前景。PCR方法，不仅可以在病原微生物属的水平上进行检测，而且可根据序列的细微差异将不同种或不同基因型的病原微生物区分开，在多种疾病的检测中显示出其传统血清学方法不可具有的优势。本研究根据布鲁菌属共有的BCSP31基因及牛、羊种布鲁菌插入序列IS711在两个种间的差异，设计合成了诊断布鲁菌属并同时鉴别牛、羊布鲁菌种的特异性引物，并对其检测能力进行了验证。结果显示所建立的多重PCR不存在交叉扩增现象，而敏感性检测证明该方法的敏感性达到100pg。建立该方法的难点在于退火温度的选择，因多重PCR每一对引物的长短不同、Tm值不一致，所以确定多种引物参与反应的的最佳退火温度难度较大，如多重引物的Tm值相差太大，将直接影响PCR方法的检测效果，因此设计引物时尽可能的将不同引物的退火温度趋于一致。一般情况下，在同等条件下短目的片段的扩增效率高于长目的片段。这个可以通过加大长片段引物的浓度来提高其扩增效果。为了使每一对引物达到相对相同的扩增效果，我们也加大了PCR反应体系中扩增效率较低的羊种引物浓度，最后确定该PCR方法的最佳条件。用所建立的多重PCR方法对19份乳样，16份阴道及粪便棉拭（布鲁菌病血清抗体虎红平板凝集、试管凝集、I-ELISA均为阳性）的核酸提取物进行扩增，所有样品均检出布鲁菌属阳性，部分样品检出牛种布鲁菌阳性，未检出羊种布鲁菌阳性样品，结果证明该方法具有良好的临床使用价值。所临床样品带菌率较高，建议在牧场饲养和奶站的原奶收购以及生鲜乳生产加工过程中，要加强防护措施，避免牛之间交叉感染和工作人员的感染。但如果被检动物处于感染初期或非排菌期，采样时并不向外界排菌，本方法将不能做到有效的检测，还有待解决。 324结论北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立1)血清学检测结果显示检测地区牛群普遍存在布鲁菌感染现象，总布鲁菌病血清抗体阳性率较高，所检牛群平均感染率达27.6%（以I-ELISA为准）。2)流行病学调查结果表明虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）和间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）检测布鲁菌病血清抗体效果存在较大差异：I-ELISA检测阳性率最高，SAT次之，RBT最低。3)本研究成功建立了检测布鲁菌病并能鉴别牛、羊种布鲁菌的诊断鉴别性多重PCR方法，经实验验证该方法具有良好的特异性、敏感性及重复性，具有良好的应用前景。 内蒙古农业大学硕士学位论文33致谢本研究是在导师希尼尼根副教授和关平原教授的共同指导下完成的。老师们对工作、事业的执着与热爱，对学术严谨，使我受益终身。在此，表示诚挚的敬意及衷心的感谢！本课题是在内蒙古农业大学兽医学院动物传染病实验室及内蒙古自治区动物疾病预防控制中心完成的，期间得到了李平安老师、周伟光老师、李银凤老师等的指导和帮助，在完成课题期间还得到了刘志国师兄、狄栋栋师兄以及刘月、张利、孙志明等同学的关心和帮助，在此致以最诚挚的感谢谢！ 34北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重PCR检测方法的建立参考文献1234567卫生部疾病预防控制局编著.布鲁氏菌病防治手册[M].北京:人民卫生出版社,2008孙承恩,马恒之,殷善述.布鲁氏菌病[M].银川:宁夏人民出版社,1985张士义,朱岱,江森林.中国布鲁氏菌病防治50年回顾[J].中国地方病防治杂2003,18(5):275～278CorbelMJ,organBWJ.Bergey'sManualofSystematicBacteriology[M].WilliamsandWilkins:Baltimore,1984:377～390CloeckaertA,VergerJM,Grayon,etal.ClassificationofBrucellaspp.IsolatedfrommarinemammalsbyDNApolymorphismattheomp2locus[J].MicrobesInfect,2001:29～38陆承平,方定一,杜念兴,等.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,2001,265～271肖东楼,王大,扬岩,等.布鲁菌病防治手册[M].北京:人民卫生出版社,2008,16～208MatyasZ,TFujikura.Brucellosisasaworldproblem[J].DevBiolStand.1984,56:3～209WilsonGS,MilesAA.Theserologicaldifferentiationofsmoothstrainsofthebrucellagroup[J].BrJExpPathol,1932,13:1.10周正任.医学微生物学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2003:209～211.11陈溥言,王川庆,刘秀梵等.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社,2006,135～14112尚德秋.动物布鲁氏菌病[M].北京:科学技术出版社,199213郝宗宇,邓文斌,宋莲军.布鲁氏菌的分子遗传学研究进展[J].国外医学—微生物学分册,1992,15(3):121～12414尚德秋,布鲁氏菌病的免疫和发病机理的研究[J].中华流行病学杂志,1987,4115BrinleyMorganWJ,andCorbelMJ.BrucellaInfectionsinManandAnimals:ContagiousEquineMetritis[C],1990,pp:547～57016CanningPC,RothJA,DeyoeBL.Releaseof5'-GuanosineMonophosphateandadeninebyBrucellaabortusandtheirroleintheintracellularsurvivalofthebacteria[J].InfectDis.1986,154:464～47017RileyLK.,andRobertson.DC.IngestionandintracellularsurvivalofBrucellaabortusinhumanandbovinepolymorphonuclearleukocytes[J].InfectImmun,1984,46:224～23018LiautardJP,AGrossJ.Dornand,andS.Kohler.InteractionsbetweenprofessionalphagocytesandBrucellaspp[J].Microbioloqia,1996,12:197～20619KohlerS,LayssacM,NaroeniA,etal.SecretionoflisteriolysinbyBrucellasuisinhibitsitsintramacrophagicreplication[J].InfectImmun,2001,69:2753～2756 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