温敏性壳聚糖-β甘油磷酸二钠盐水凝胶的初步研究论文

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1、温敏性壳聚糖/β甘油磷酸二钠盐水凝胶的初步研究论文【摘要】目的探讨温敏性壳聚糖/β甘油磷酸二钠盐水凝胶应用于软骨再生的可行性。方法制备壳聚糖/β-甘油磷酸二钠盐水凝胶。将体外培养的小鼠软骨细胞与水凝胶共培养，采用荧光倒置显微镜观察细胞在三维材料上生长分布的状态。选取共培养1、2周的细胞/水凝胶复合物，采用RTPCR半定量的方法，检测Ⅱ型胶原和聚合素两种细胞外基质在mRNA转录水平上的差异。结果制备的水凝胶具备生理性的pH值，在常温下为液态，体温状态下为胶冻状。荧光倒置显微镜显示共培养2周时软骨细胞呈球状生长。细胞/水凝胶复合

2、物共培养2周后，Ⅱ型胶原和聚合素的合成增加。结论壳聚糖/β甘油磷酸二钠盐水凝胶具有温度敏感性，是一种生物相容性的温固化凝胶。【关键词】壳聚糖；β甘油磷酸二钠盐；温度敏感材料ABSTRACT：ObjectiveToinvestigatethefeasibilityofnovelthermallysensitivechitosan/β-glycerophosphate(Ch/GP)hydrogelforchondrocytesregeneration.MethodsCh/GPhydrogelsicroscopy(FIM)ensio

3、naldistributioninthehydrogels.TheexpressionofulationspossessaphysiologicalpHandcanbeheldliquidbelotemperatureforencapsulatinglivingcells;theyformmonolithicgelsatbodytemperature.FIMshoalizedratioofcollagentypeⅡandaggrecansignificantlyincreasedat2etheuseofCh/GPaqueousso

4、lutionsasgellingsystems,suggestingthediscoveryofaprototypeforaneilyofthermosettinggelshighlypatibleallyresponsivematerial关节炎或者运动损伤造成的关节软骨变性能影响各个年龄层次的身体健康。关节软骨的营养仅来自于关节滑液,无血液、淋巴循环,亦无神经支配,损伤后其自身修复能力较差,关节软骨的缺损修复一直是临床上尚未解决的难题。水凝胶是亲水的聚合物网络,它能够吸收大量的水分,但由于聚合物链间的物理交联和化学交联作用而不

5、会溶解于水中,只能溶涨且保持一定的形状1。最低临界温度介于室温和体温之间的温度敏感性水凝胶因其在组织再生2-4、细胞传递和细胞治疗5-8方面的应用日益受到人们的关注。温度敏感性水凝胶非常适合用于关节软骨再生.freela公司），培养液（DMEM）和胎牛血清（Gibico公司）。其他试剂均为分析级。1.2制备chitosan/GP复合凝胶将壳聚糖粉剂200mg溶解于10ml0.1M的乙酸溶液中，边添加边用磁力搅拌器搅拌，至少1h。溶解完全后高温高压消毒20min。将GP粉剂溶解于去离子水（45％，in后，将冷的GP溶液逐滴滴加到冷的

6、壳聚糖溶液中，边滴加边轻轻摇晃。混合完全后壳聚糖和GP的终浓度分别为1.8％和7.3％（l青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM重悬，置于37℃的细胞培养箱中培养。当原代培养成功细胞生长增殖形成单层细胞后，进行传代培养。在冰浴的环境下，传至4～5代的细胞用纯的胎牛血清重悬后逐滴与Ch/GP溶液混合，使细胞的密度达约106个/ml。将混合溶液小心倾倒入无菌的6孔板中，在37℃的细胞培养箱中培养30min使其完全凝固，然后添加含有10％的胎牛血清的DMEM继续培养,每3天换液。对培养1、2周的细胞/水凝胶复合物进行荧光倒置显微镜观察

7、。采用免疫荧光染色方法处理标本，即刻观察并照相。1.4逆转录聚合酶链反应（RTPCR）选取共培养1、2周的细胞/水凝胶复合物，采用RTPCR半定量的方法，检测Ⅱ型胶原和聚合素（aggrecan）两种细胞外基质在mRNA转录水平上的差异。2结果2.1Ch/GP一般特征壳聚糖稀盐酸溶液呈淡黄色粘稠状透明液体，pH值5.6；GP水溶液呈无色透明液体，pH值9.7。随着GP溶液的逐滴滴加，壳聚糖溶液逐步变得清亮透明，混合后pH值为6.8,.freelin，较好的满足可注射支架材料的要求，适宜细胞存活，方便术中操作。Ch/GP凝胶大体观

8、呈半透明瓷白色，触压有一定的韧性。2.2软骨细胞在Ch/CMC凝胶中的三维培养细胞在凝胶中生长、分布情况如图1所示。细胞定植在凝胶中，视角聚集到凝胶的不同层面可见软骨细胞呈三维较均匀分布。培养2周（图1）的细胞－水凝胶复合物用AO染色，荧光倒置显微