实验arabidopsis叶片总rna的提取及浓度测定1

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1、Arabidopsis叶片总RNA的提取及浓度测定RNAisoPlus是广谱型TotalRNA提取试剂。实验操作快速方便，颜色鲜明，便于分层。本制品可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取TotalRNA。样品在RNAisoPlus中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（鲜红色下层），RNA分布在上层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到TotalRNA。TakaraRNAisoPlusRNAextractionfromArabidopsisleavesRNAisoPlus

2、具有以下特性：1.广谱性强。可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取TotalRNA。2.纯度俱佳。提取的TotalRNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。3.快速简便。实验操作快速方便，整个操作在一小时内便可完成。4.颜色鲜明。加入氯仿离心后，会形成无色的上清层和鲜红色的下层（有机层）。●RNA提取实验前的准备RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所

3、用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。（1）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。【试剂配制】用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟

4、）或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。●实验操作1.RNAisoPlus的使用量情况如下2.实验样品的研磨和匀浆A.贴壁培养细胞①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。②每10cm2生长的培养细胞中加入1ml的RNAisoPlus，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细

5、胞）。③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。④室温静置5分钟。B.悬浮培养细胞①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000g4℃离心2分钟，弃上清。②向每107个细胞中加入l～2ml的RNAisoPlus。③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。④室温静置5分钟。C.动物组织、植物材料样品①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。②对于普

6、通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAisoPlus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAisoPlus的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。③将粉末用药勺转移至离心管中，加入1mlRNAisoPlus,室温静置5分钟。④12,000g4℃离心5分钟。⑤小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。3.TotalRNA的提取。①向上述步骤2的

7、匀浆裂解液中加入氯仿（RNAisoPlus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5分钟。②12,000g4℃离心15分钟。③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。④向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。⑤12,000g4℃离心10分钟。一般在离心后，试

8、管底部会出现沉淀。4.RNA沉淀的清洗。小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。5.RNA的溶解。室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则