辣椒叶片总RNA快速提取.doc

《辣椒叶片总RNA快速提取.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、辣椒叶片总RNA快速提取　　摘要：采用改良的Ｔｒｉｚｏｌ法对辣椒叶片的总ＲＮＡ进行了提取，利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、ＲＴ－ＰＣＲ进行ＲＮＡ纯度、完整性检测。结果表明，Ｔｒｉｚｏｌ法提取可获得较高质量的辣椒叶片总ＲＮＡ，能满足后续的研究需要。　　关键词：辣椒；总ＲＮＡ；改良Ｔｒｉｚｏｌ法；提取　　中图分类号：Ｑ５２２；Ｓ６４１．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11417－3630-02　　　　ＲａｐｉｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＴｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍCapsicumannuumＬｅａｖｅｓ　　

2、　　ＬＩＸｉａｏ－ｘｉａ，ＸＩＡＯＺｈｏｎｇ－ｊｉｕ，ＳＯＮＧＰｅｉ－ｙｏｎｇ，ＺＨＯＵＸｕｎ，ＸＩＥＹｕ　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｒｉｚｏｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｍｏｄｉｆｉｅｄｔｏextractｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍCapsicumannuumｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆａｇａｒｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒａｙｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒａｎｄＲＴ－ＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｍｏｄｉｆｉｅｄＴｒｉｚｏｌm

3、ethodｗａｓｏｆｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙ，ａｎｄｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｄｏｗｎｓｔｒｅａｍａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Capsicumannuum；ｔｏｔａｌＲＮＡ；ｍｏｄｉｆｉｅｄＴｒｉｚｏｌｍｅｔｈｏｄ；extraction　　　　植物组织中总ＲＮＡ的提取是植物分子生物学研究的基本技术之一，高质量ＲＮＡ的获得是进行ＲＴ－ＰＣＲ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、ｃＤＮＡ文库构建等分子生物学研究的前提条件［１，２］。植物组织中富含纤维等多糖物质，很容易与ＲＮＡ发生共沉淀［３］，此外ＲＮａｓｅ

4、非常稳定，极易导致ＲＮＡ降解，因此要获得纯度高、完整性好的高质量ＲＮＡ有一定的难度。辣椒叶片富含纤维、多糖和酚类物质，对总ＲＮＡ提取方法进行探讨，以获得理想的效果就显得尤为重要。本研究在尝试了多种提取方法的基础上，使用改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取辣椒叶片总ＲＮＡ，以期为后续的研究奠定良好的基础。　　１材料与方法　　１．１材料与试剂　　实验用辣椒材料为西安８８１９、牛角椒、遵义朝天椒，从市场上购买种子，实验室盆栽，取花期辣椒叶片，用７５％乙醇进行表面清洁后晾干，无菌刀片切取０．１ｇ，称重后立即用于实验或用锡箔纸包

5、裹后进行液氮速冻，置于－８０℃冰箱保存。　　Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，焦碳酸二乙酯购自生工生物工程有限公司，反转录试剂盒及ＰＣＲ用品购自宝生物工程有限公司，引物由天根生化科技有限公司合成，其他试剂均为国产分析纯。试剂均用０．１％ＤＥＰＣ水配制，塑料耗材用０．１％ＤＥＰＣ水处理过夜后湿热高温灭菌；研钵等器皿在１８０℃烘烤６ｈ以上，以避免ＲＮＡ酶污染［４］。　　１．２方法与步骤　　１．２．１总ＲＮＡ的提取参照Ｔｒｉｚｏｌ试剂使用说明并作改良。①取辣椒叶片材料，置于预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速

6、研磨成粉末，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ试剂，充分匀浆；②转入无ＲＮａｓｅ的２ｍＬ的离心管，室温溶化后加入５００μＬ等体积的酚、氯仿混合液，剧烈震荡混匀５ｍｉｎ，４℃、１３５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，③吸取上层水相至另一离心管中，加入０．５ｍＬ预冷的异丙醇混匀，室温放置１０ｍｉｎ，４℃　　１３５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清。④加入７５％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，重复两次，４℃、　　７５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，超净工作台吹干，溶于３０μＬＲＮａｓｅｆｒｅｅ水，－８０℃储存。　　１．２．２凝胶电

7、泳检测ＲＮＡ的完整性取６μＬ提取的ＲＮＡ样品进行１％琼脂糖凝胶电泳，检测样品的完整性。　　１．２．３总ＲＮＡ纯度的测定取５μＬ提取的ＲＮＡ样品用ＲＮａｓｅｆｒｅｅ水稀释到２００μＬ，用７５２型紫外分光光度计分别测定在２６０、２８０ｎｍ波长下样品的ＯＤ值，判断其纯度。　　１．２．４ＲＴ－ＰＣＲ扩增辣椒ａｃｔｉｎ基因ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ链后，选用辣椒持家基因ａｃｔｉｎ基因进行ＰＣＲ，以验证提取的ＲＮＡ是否可用，其特异性引物为Ｐ１：５′－ＡＧＧＧＡＴＧＧＧＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣ－３′，Ｐ２：５′－ＧＡＧＡＣ

8、ＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＣ－３′，目标片段大小为２８９ｂｐ；ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，包括反转录ｃＤＮＡ模板１μＬ，１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ＭｇＣｌ２２．５μＬ，ｄＮＴＰｓ０．５μＬ，引物各１μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１６μＬ。ＰＣＲ扩增在ＰＴＣ－２００型扩增仪上完成，ＰＣＲ反应程序为：９４℃，３ｍｉｎ；９４℃，３０ｓ，５８℃，４５ｓ，７２℃，１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延