实验 微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的vc含量

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1、主讲教师：肖小华微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的维生素C含量实验学时：5学时实验名称：实验目的、内容及要求高效液相色谱简介HPLC的使用与维护HighPerformanceLiquidChromatography一、高效液相色谱法历史回顾；基本原理与概念；HPLC定性与定量方法；HPLC仪器组成。一、历史回顾色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用；40年代，TLC，纸色谱，柱层析；50年代，GC出现使色谱具备分离和在线分析功能；60年代末HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩大；1．新型固定相和检测器2．联用仪器：GC-MS，HPLC-MS3．智能化发展1937-1

2、972年，35年中有12个Nobel奖是与色谱研究相关的！固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚色带色谱（Chromatography）一词来源于希腊语中“chroma”=color;“graphein”=write二、基本原理当流动相中携带的混合物流经固定相时，与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测；两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。色谱法分类1．

3、按两相分子的聚集状态分：气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱气相色谱液相色谱液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱2．按固定相的固定方式分：平面色谱纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱填充柱色谱毛细管柱色谱3．按分离机制分：分配色谱：利用分配系数的不同吸附色谱：利用物理吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换原理空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：高选择性——可将性质相似的组分分开高效能——反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度——10-11-10-13g，适于痕量分析分析速度快——1min-1hr;一次可以测多种样品应用范围广——气体，液体、固

4、体物质化学衍生化再色谱分离、分析对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)一些基本概念1.分配系数(partitionfactor)K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K表示，即：分配系数是色谱分离的依据。2.分配比(partitionradio)k是指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。在实际工作中，常用来表征色谱分配平衡过程。1、分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化；2、分配系数与分配比都

5、是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长；3、分配比可以由实验测得。分配比也称：容量因子(capacityfactor)或容量比容量因子与分配系数的关系式中β为相比。容量因子越大，保留时间越长；VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同；气-液色谱柱：VS为固定液体积；气-固色谱柱：VS为吸附剂表面容量；分配比与保留时间的关系保留因子(retentionfactor)：us：组分在分离柱内的线速度；u：流动相在分离柱内的线速度；保留因子RS也可以用质量分数ω表示：若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别

6、为tR和tM，则：由以上各式，可得：tR=tM(1+k)3.色谱流出曲线（色谱图）混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应关于色谱图的几个基本术语1、基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2、保留值保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；死时间（tM）：不与固定相作用的气体或液体的保留时间；调整保留时间(tR＇)：tR＇=tR－tM也可用体积表示，对应为保留体积、死体积和调整保留体积3、相对保留值r21组分2与组分1调整保留值之比：r21=t´R2/t´R1=V´R2/V´R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对

7、这两种组分的选择性。色谱流出曲线的意义：色谱峰数=样品中单组份的最少个数；色谱保留值——定性依据；色谱峰高或面积——定量依据；色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。4、区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度W1/2=2.354（3）峰