肺神经内分泌细胞及其肿瘤的形态学分析

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1、中文摘要现存在于胰腺等外周器官并被证实有收缩血管的作用。那么NPY是否也存在于肺内?肺内分泌细胞能否合成NPY?NPY在肺内的作用及与其他活性物质的关系是怎样的?这成为本课题设计的一个目的。国内外学者对肺神经内分泌细胞进行的一系列观察和报道发现，肺神经内分泌细胞在胚胎发育过程中异常活跃，与其在正常成体肺组织存在很大的差异。因此，对动物肺内NPY、5-HT、CGRP所表达的增龄变化的观察将有助于我们对肺的发生、发育的全面了解。本课题以嗜铬颗粒蛋白A，即嗜铬素A(chromograninA，CgA)作为肺神经内分泌细胞的特异性标记物，首先从翻译和转

2、录两方面对NPY在肺内的表达进行了研究；同时对NPY与5-HT、CGRP和CgA在肺神经内分泌细胞内的关系进行了观察。然后对增龄大鼠肺内NPY、5-HT和CGRP表达的变化进行了动态观察。晚近的研究认为，肺神经内分泌肿瘤与胚胎肺发育中神经内分泌细胞有某些相似之处。因此，我们对NPY在肺神经内分泌肿瘤的表达进行了观察，以期为肺内分泌肿瘤发生的病理学提供实验资料。CgA由于能与特异性激素结合而广泛存在于神经内分泌细胞及其肿瘤的内分泌颗粒中，被认为是神经内分泌细胞和神经内分泌肿瘤特异、敏感、可靠的标记物。在神经内分泌癌的病理诊断学上具有十分重要的意义

3、。本实验中用CgA作为肺神经内分泌细胞的特异性标记物，观察CgA与NPY、5-HT、CGRP在肺NEC中的关系；比较CgA与其他标记物在人肺神经内分泌肿癌中阳性表达的情况，以期为肺内分泌肿瘤的临床病理诊断提供一定的形态学参考。第一部分：NPY与5-HT、CGRP、CgA在大鼠肺组织的表达目的：观察大鼠肺内NPY免疫反应阳性物质的表达情况；观察NPY同CGRP、5-HT、CgA免疫反应阳性细胞的关系。初步探讨这些活性物质之间的关联性，为揭示肺的内分泌机制、进一步认识肺的结构和功能提供形态学资料。方法：应用免疫组化单标、免疫荧光双标和原位杂交技术，

4、利用光镜、透射电镜和激光共聚焦扫描显微镜进行观察、照相。光镜、激光共聚焦扫描显微镜切片制备：选用健康新生和孕20日SD大鼠各6只，雌雄不限。新生大鼠结扎气管后迅速断头放血，行Bouin液气管中文摘要灌注，再全肺固定1小时。待肺组织稍稍变硬后，选取带有各级支气管的左上肺组织多块，置入相同的固定液中固定；孕鼠活杀后迅速打开子宫，取出活胎鼠，打开胸腔取全肺浸入新配制的Bouin液固定。常规石蜡包埋、连续切片，片厚6um。分别进行以NPY、5-HT、CGRP和CgA为一抗的免疫组织化学染色：按一抗不同种属来源分别进行CGI心与NPY、CGRP和5-HT

5、；CgA与NPY、CgA和5-HT荧光双标免疫组织化学染色；以NPY寡核苷酸为探针进行原位杂交。透射电镜样品制备：实验动物秤重、麻醉后，取材步骤同上，固定液采用2．5％戊二醛，肺组织取材后切为lmm3的细块。投入相同的固定液中，室温下固定48小时。将组织块经PBS充分冲洗，l％锇酸后固定。丙酮梯度脱水，Epon812包埋。Leica超薄切片机切片，片厚70nm。枸橼酸铅和醋酸铀染色，日立H．7500型透射电子显微镜观察。结果：1．光镜观察结果：①NPY免疫反应阳性细胞以单个神经内分泌细胞(NEC)多见，而神经上皮小体(NEB)较少，在肺内支气管

6、树的粘膜上皮细胞中均有分布。可见NPY．IR阳性神经纤维，主要位于气道平滑肌和血管壁。②cGIo免疫反应阳性细胞可为单个神经内分泌细胞或多个神经内分泌细胞组成的神经上皮小体，零散分布于肺内支气管树的粘膜上皮细胞中。在有些NEB的基底部可观察到呈CGRP．IR阳性的神经纤维，沿肺内支气管和血管分支走行的神经纤维亦可呈CGRP．IR阳性。③5．HT免疫反应阳性细胞可见于各级支气管粘膜壁上，数量较少。在气道平滑肌和血管壁未观察到5-HT．IR阳性纤维。④CgA免疫反应阳性细胞多为锥形、柱形，胞浆着色呈浅黄色，细胞核较大不着色，多位于肺内支气管粘膜上皮

7、。与NPY、CGRP和5-HT免疫反应阳性细胞的表达部位基本一致。2．原位分子杂交结果：在支气管的粘膜上皮细胞中可见NPYmRNA。3．相邻切片法、免疫组化光镜观察和免疫荧光双重标记激光扫描共聚焦显微镜结果：NPY、5-HT、CGRP既可单独存在于肺神经内分泌细胞中，也可共存于同一肺的神经内分泌细胞中。其中以共存的情况较为多见，单独存在者较少。4．用CgA作为肺神经内分泌细胞的特异性标记物，利用免疫荧光双重标记激光扫描共聚焦显微镜观察结果：多数表达NPY、5-HT的NEC中也含有CgA免疫发应物，少数表达NPY、5-HT的NEC中不中文摘要表达

8、CgA。5．透射电镜观察结果：可以见到肺的神经内分泌样细胞附着在基底膜上，可呈锥形、柱状、不规则形等，细胞核呈圆形或卵圆形。胞质内富含致密核心小泡(D