骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞与wntβ-catenin通路中β-catenin的关系分析

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1、本课题获得以下资助：湖南省自然基金13jj5019摘要目的扩张型心肌病(dilatedcardiomyoPathy，DCM)为死亡率较高的一种疾病，目前尚未报道其有效的治疗措施。近些年研究的干细胞治疗技术为它带来了新的曙光。本研究试图通过5-aza诱导骨髓间充质干细胞分化1j擎为心肌细胞，并了解在该过程中Wnt／13．catenin信号通路是否参与分化过程的调控，旨在为临床充分利用来源丰富的BMSCs(bonemarrowmesenchymalcells，BMSCs)移植治疗终末期扩张型心肌病提供有效的实验依据。方法：从2009左右的SD雄性大鼠股骨提

2、取BMSCs，利用贴壁培养方法，篷培养至P3代细胞后利用流式细胞仪(flowcytometry，FCM)来检测细胞的表面抗原：主要选取CD29、CD34、CD45、CDl05等四种表面抗原进行检测，从而达到鉴定骨髓间充质干细胞的目的。台盼蓝染色计数细胞活性。选择活性较好，纯度较高的细胞制成细胞悬液，随机均匀分成a组、b组、c组、d组，分别用O岬ol／L，5I_tmol／L，lOItmol／L，201．Lmol／L的5-aza进行干预，2周后比较总体细胞水平的活性率及心肌细胞的百分比，从而确定诱导分化的最佳浓度。此后将P3代骨髓间充质干细胞随机分成2组，

3、即实验组及对照组。实验组为A组需加入最佳诱导浓度的5-aza培养24h诱导分化，经处理后更换为不含5-aza的培养基继续培养4周，根据培养时间的不同分成四组，即为培养第1周末、第2周末、第3周末、第4周末的各组细胞，分别对应为A1、A2、A3、A4四组。对照组B组不添加5-aza，参照A组的分组方法分别分为B1、B2、B3、B4四组；对各组细胞进行如下操作：①记录不同时期细胞的生长状态及形态；②行免疫荧光检测心肌细胞中的特异性cTnT来鉴定心肌细胞，计数心肌细胞百分比；③采用蛋白印迹法(westernblot,WB)检测各组cTnT及p-eatenin

4、蛋白表达量，比较各组蛋白表达的变化。结果：应用FCM检测显示贴壁法培养获取的P3代BMSCs高表达CD29、CDl05(分别为93．37％、89．08％)；而极少的表达CD34、CD45(分别为O．89％、1．06％)。经台盼兰试验测定其整体活细胞百分率>95％；通过对P3代BMSCs分别加入浓度为01xmol／L，519nol／L，109mol／L，209mol／L的5-aza进行干预的a组、b组、c组、d组，2周后细胞的活性率及心肌细胞的百分率分别如下：①总细胞活性率：a组为94．2士7．4(％)，b组为93．6+7．1(％)，c组93．5+6．7

5、(％)，d组80．1+9．2(％)，将各组数据行方差分析得出，a组、b组、C组各组细胞间总细胞活性率无明显差异，但与d组比较，P0．05，无统Ⅱ计学意义。综合分析得出：C组即经109mol／L的5-aza处理可将BMSCs诱导分化为心肌细胞，总细胞活性率较高。由BMSC分化而来的心肌细胞经标记特异性cTnT蛋白的免疫荧光染色后，在显微镜下表现为染红色荧光的细

6、胞，各组心肌细胞百分比分别为：A1组及B组所有组别细胞显镜下未见心肌细胞形成，百分比为0(％)；A2心肌细胞百分率为3．33+1．53(％)；A3组心肌细胞百分比为19．67+1．53(％)，A4组为25．67士2．1(％)。将所得数据行方差分析得出A2、A3、A4各组间P40．05，有统计学差异。westernblot技术检测cTnT的表达结果，A2组(1．231+0．017)、A3组为(6．606+0．227)、A4为(8．511士0．392)明显高于B1(O．824+0．012)、B2(0．826+0．138)、B3(O．827+0．02)、B4

7、(0．827+0．004)，A1(0．819+0．062)，A组、B组行配对t检验后得出，A2与B2、A3与B3、A4与B4，P<0．05，有统计学意义，A1与B1，P>0．05，无明显差异。A1、A2、A3、A4各组行方差分析，P<0．05，各组间存在差异；B组行方差分析则未见差异。免疫荧光与westernblot检测cTnT结果是相一致的。各组细胞p—catenin蛋白的表达结果为：B组各组细胞p．catenin蛋白的表达检测不出。A组各组表达如下：A1(1．877+0．044)、A2(7．634+0．329)、A3(1．084+0．092)、A4

8、(O．473+0．025)，经方差分析得出各组之间差异有统计学意义。结论：1．全骨髓贴壁法培养