骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞与wntβ-catenin通路中β-catenin的关系

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1、分类号学校代码10542骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞与Wnt／p．catenin通路中p．catenin的关系Therelationshi。Pbetweendifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellsintomyocardialcellsandthe13-cateninofWnt／[3--cateninPathway指导教师姓名、职称笪堂坐圭堡匡垭湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一四年五月本课题获得以下资助：湖南省自然基金13j5019目的摘要扩张型心肌

2、病(dilatedcardiomyoPathy，DCM)为死亡率较高的一种疾病，目前尚未报道其有效的治疗措施。近些年研究的干细胞治疗技术为它带来了新的曙光。本研究试图通过5-aza诱导骨髓间充质干细胞分化1j擎为心肌细胞，并了解在该过程中Wnt／13．catenin信号通路是否参与分化过程的调控，旨在为临床充分利用来源丰富的BMSCs(bonemarrowmesenchymalcells，BMSCs)移植治疗终末期扩张型心肌病提供有效的实验依据。方法：从2009左右的SD雄性大鼠股骨提取BMSCs，利用贴壁培

3、养方法，篷培养至P3代细胞后利用流式细胞仪(flowcytometry，FCM)来检测细胞的表面抗原：主要选取CD29、CD34、CD45、CDl05等四种表面抗原进行检测，从而达到鉴定骨髓间充质干细胞的目的。台盼蓝染色计数细胞活性。选择活性较好，纯度较高的细胞制成细胞悬液，随机均匀分成a组、b组、c组、d组，分别用O岬ol／L，5I_tmol／L，lOItmol／L，201．Lmol／L的5-aza进行干预，2周后比较总体细胞水平的活性率及心肌细胞的百分比，从而确定诱导分化的最佳浓度。此后将P3代骨髓间充质

4、干细胞随机分成2组，即实验组及对照组。实验组为A组需加入最佳诱导浓度的5-aza培养24h诱导分化，经处理后更换为不含5-aza的培养基继续培养4周，根据培养时间的不同分成四组，即为培养第1周末、第2周末、第3周末、第4周末的各组细胞，分别对应为A1、A2、A3、A4四组。对照组B组不添加5-aza，参照A组的分组方法分别分为B1、B2、B3、B4四组；对各组细胞进行如下操作：①记录不同时期细胞的生长状态及形态；②行免疫荧光检测心肌细胞中的特异性cTnT来鉴定心肌细胞，计数心肌细胞百分比；③采用蛋白印迹法(w

5、esternblot,WB)检测各组cTnT及p-eatenin蛋白表达量，比较各组蛋白表达的变化。结果：应用FCM检测显示贴壁法培养获取的P3代BMSCs高表达CD29、CDl05(分别为93．37％、89．08％)；而极少的表达CD34、CD45(分别为O．89％、1．06％)。经台盼兰试验测定其整体活细胞百分率>95％；通过对P3代BMSCs分别加入浓度为01xmol／L，519nol／L，109mol／L，209mol／L的5-aza进行干预的a组、b组、c组、d组，2周后细胞的活性率及心肌细胞的百分

6、率分别如下：①总细胞活性率：a组为94．2士7．4(％)，b组为93．6+7．1(％)，c组93．5+6．7(％)，d组80．1+9．2(％)，将各组数据行方差分析得出，a组、b组、C组各组细胞间总细胞活性率无明显差异，但与d组比较，P0．05，无统Ⅱ计学意义。综合分析得出：C组即经109mol／L的5-aza处理

7、可将BMSCs诱导分化为心肌细胞，总细胞活性率较高。由BMSC分化而来的心肌细胞经标记特异性cTnT蛋白的免疫荧光染色后，在显微镜下表现为染红色荧光的细胞，各组心肌细胞百分比分别为：A1组及B组所有组别细胞显镜下未见心肌细胞形成，百分比为0(％)；A2心肌细胞百分率为3．33+1．53(％)；A3组心肌细胞百分比为19．67+1．53(％)，A4组为25．67士2．1(％)。将所得数据行方差分析得出A2、A3、A4各组间P40．05，有统计学差异。westernblot技术检测cTnT的表达结果，A2组(1．

8、231+0．017)、A3组为(6．606+0．227)、A4为(8．511士0．392)明显高于B1(O．824+0．012)、B2(0．826+0．138)、B3(O．827+0．02)、B4(0．827+0．004)，A1(0．819+0．062)，A组、B组行配对t检验后得出，A2与B2、A3与B3、A4与B4，P<0．05，有统计学意义，A1与B1，P>0．05，无明显差异。A1、A2、A