wntβ-catenin信号转导途径wnt通路

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Wnt/β-catenin信号转导途径 Wnt信号通路人类Wnt基因家族由19个成员组成，编码具有22或24个半胱氨酸残基的保守糖蛋白。Wnt信号转导途径可以分为决定细胞命运的经典途径和控制细胞运动及组织极性的非经典途径。 Wnt途径的发现Wnt基因于1982年发现，最初是作为小鼠乳腺肿瘤病毒优先整合的位点而被鉴定的，该基因能在细胞间传递增殖和分化信息，是一种癌基因，当时被命名为Int基因(小鼠Int-1和Int-3)。随后发现它与果蝇的无翅基因(wingless)属直相同源基因(orthologousgene)，从而将二者结合命名为Wnt基因。随着研究的不断深入人们发现Wnt基因家族非常庞大，为多基因家族，其基因结构从低等的无脊椎动物到脊椎动物乃至人类具有高度保守性，其同源序列达27-83%，对动物的生长发育起着至关重要的作用。Wnt基因编码的WNT蛋白，可启动细胞内信号传导途径，传导生长刺激信号，参与不同的发育机制，如细胞分化，移行，以及决定细胞命运的增殖等。因其启动蛋白为WNT蛋白，故命名为Wnt信号途径。 1996年，Wnt途径的主要成员被相继确定和克隆。研究发现，这一信号途径主要包括三个环节，即由Wnt配体与胞膜受体的特异性结合，引发胞内一系列级联反应，进而调节核内的基因表达。传统的信号途径系统观点认为，信号是从细胞表面到细胞核的线性传递。Wnt信号途径的起点为胞膜，由分泌性信号蛋白Wnt，通过跨膜的受体蛋白，经由多种细胞内蛋白将信号传至细胞核内。这点上看，它是一种与传统观点相一致的信号途径系统。然而许多研究发现，Wnt途径和其他细胞功能、信号传递过程相互交叉，不是直线型的结构，而是一个网络调节模式，具有几个关键调控点。 Wnt途径总的框架1.Wnt/β-cantenin途径，即典型的Wnt/β-cantenin信号途径(canonicalWnt/β-canteninpathway)。该途径通过β-cantenin的核易位，激活靶基因的转录活性。2.平面的细胞极性途径(planarcellpolaritypathway)，涉及RhoA和JunN端激酶以及细胞骨架的重排。目前还没有实验资料证明该途径参与肿瘤的发展。3.Wnt/ca2+途径，由Wnt5a和Wnt11激活，增加胞内Ca2+含量，激活蛋白酶C、磷脂酶C和转录因子NF-AT。Wnt/Ca2+途径可以和典型的Wnt/β-cantenin信号途径相互作用，但是该途径在肿瘤发生中是否起作用尚不清楚。 Wnt信号途径 Wnt途径的组成和实现研究Wnt途径的组成，主要运用基因和分子生物学相结合的手段加以分析与认定，Wnt途径候选分子的确定标准为：该分子失去功能显性，则Wnt信号途径的功能即消失，而该分子获得功能时，Wnt信号途径也同时具有功能。经过十多年的研究，目前认为Wnt途径的主要组成为：Wnt信号蛋白，胞膜受体FZD家族，胞浆内β-catenin、Dsh、APC、GSK3等蛋白分子,细胞核内LEF/TCF转录因子家族等。 胞内信号传递Wnt信号进入胞内后，将信号传递给Dishevelled(Dsh)，活化的Dsh抑制由Axin、APC(adenomatouspolyposiscoli)和GSK-3β(serin/threonineglycogensynthasekinase3β)组成的复合物的活性,使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化。磷酸化的β-catenin才可通过遍在蛋白化(ubiquitination)而被胞浆内的蛋白酶体所降解，由于非磷酸化的β-catenin不能被蛋白酶体降解，从而导致β-catenin在胞浆内积聚，并移向核内。当游离的β-catenin进入细胞核内，即可与转录因子TCF/LEF(T-cellfactor/Lymphoidenhancerfactor)结合，激活TCF转录活性，调节靶基因的表达。因此,β-catenin是否磷酸化是该信号传递的关键因素。 靶基因目前已经研究鉴定出多种Wnt途径的靶基因，它们在细胞增殖、分化以及肿瘤形成中起重要作用。主要包括：细胞周期和凋亡相关基因c-myc和cyclinD1,生长因子如VEGF(vascularendothelialgrowthfactor),胃泌素(gastrin)、HGF(hepatocytegrowthfactor)、c-met等。参与肿瘤进展的基因MMP7(matrilysin)、MMP26、CD44和Nr-CAM,转录因子ITF-2(immunoglobulintranscriptionfactor-2)和Id2,其他靶基因如COX-2等.由于这些因子在细胞增殖、分化以及肿瘤发生发展中分别体现不同的特点，因此Wnt信号传递是一种由多因子组成、涉及多个环节、多种调控的复杂过程。 在正常生长的成熟机体中，细胞的生长、增殖和分化等具有一定的规律性和有序性。有限生长的细胞在没有Wnt信号时，Wnt通路呈关闭状态。但当Wnt途径激活时，就可能导致许多细胞出现灾难性的变化，使细胞发生异常的增生和分化，导致肿瘤形成。 Wnt途径异常激活主要见于：1）组成Wnt途径的蛋白、转录因子或基因被破坏或变异，导致该途径关闭或局部途径异常活跃；2）过多Wnt信号使整个途径异常活跃，细胞进行不必要的增殖；3）细胞内其他因素通过Wnt途径来刺激或诱发细胞产生异常反应。 在Wnt途径中,β-catenin-TCF/LEF复合体无疑是Wnt途径的枢纽。如前所述，Wnt途径激活是以β-catenin定位变化-易位为基础，一旦β-catenin易位于细胞核内，与TCF/LEF结合，即可启动Wnt途径。因此，Wnt途径的调控可分为两部分：上游各组分结构和功能变化导致β-catenin降解障碍，引起β-catenin胞浆内积聚；核内β-catenin激活TCF/LEF引起下游靶基因转录，通过推动细胞周期发展或产生异常蛋白，使细胞发生癌变。 β-catenin是第一个被确定为Wnt途径的成员。在细胞内,β-catenin具有二个定位池：一个是位于细胞膜,与E-cadherin和α-catenin形成粘附复合体，参与细胞黏附；另一个则在胞浆。β-catenin基因定位于3p21，由16个外显子组成，其中外显子3的第37，33，41，45位密码子编码区域构成β-catenin蛋白的NH2末端，是GSK3的结合部位，也是致癌活化的位点，该区域的定向突变或缺失可导致β-catenin活性过高，致使GSK3对β-catenin降解受阻，β-catenin在胞浆内积聚。Clements对311例胃癌标本进行β-catenin的检测，发现29%病例存在β-catenin核内易位，19%存在3号外显子突变。 研究发现，许多肿瘤中存在着不同程度的β-catenin基因突变。如结直肠癌、肝细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌和皮肤癌,β-catenin突变率可达50％以上，前列腺癌、子宫内膜癌和Wilms’瘤等为15％左右，胃癌为26％。突变位点多集中在外显子3区域，特别是GSK3的结合部位。β-catenin的定位改变，除了受其本身基因突变的影响外，Wnt途径上游各组分形态和功能的变化也可影响β-catenin的状态。主要包括Wnt,APC,GSK-3和Axin。 APC(adenomatouspolyposiscoli)是一种与结肠癌发生有关的抑癌基因。定位于5q21，长度10.4kb，编码一组较大的多结构域蛋白，属于胞浆蛋白，具有支架蛋白的作用。APC蛋白、Axin和GSK3,可与β-catenin形成复合物，而促进β-catenin发生磷酸化，使β-catenin得以被蛋白酶降解。在固有的和散在的大多数结直肠肿瘤中，均已发现有APC基因的突变或缺失。APC基因突变可发生于任何外显子，其中以第15外显子（654-2843密码子）最为常见［2000］，1020-1169密码子和1323-2075密码子编码区域被认为是β-catenin与APC的结合位点，该区域突变即导致β-catenin不能与APC结合，进而不能被GSK3磷酸化，以致β-catenin降解受阻而积聚于胞浆。因而APC是Wnt途径的负调控因子。在其他癌症如髓母细胞瘤，侵袭性纤维瘤病，乳腺癌等也可见APC异常。 Axin具有多个蛋白-蛋白作用域，与APC一样起支架蛋白的作用，是支架蛋白复合体的构建基础。Axin的RGS功能域(regulatorsofGproteinsignalingdomain)，能与全长的APC结合，但不能与截短的无活性APC结合。APC-Axin-GSK-β-catenin形成复合物时，GSK靠近β-catenin而促使其磷酸化，因此也是Wnt途径的负调控因子。在肝癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤中检测到Axin基因突变，目前Axin被认为是抑癌分子，其基因突变可促进肿瘤的发生。 GSK(serin/threonineglycogensynthasekinase3β)可使β-catenin磷酸化，磷酸化位点为β-catenin的4个N端位点（s33,s37,T4,s45），这些磷酸氨基作为β-catenin磷酸化的一种标志，表明它将被蛋白酶体通过水解而降解。GSK3是Wnt途径的负调控因子，同时也是候选抑癌分子。在Wnt信号通路发生异常时是否存在GSK3的突变问题尚少探讨，但已有在结肠癌中没有检测到GSK3突变的报道，GSK3是否具有其他功能，以及可能在其他途径中发挥重要的作用还有待研究。 DSH(Dishevelled)是Wnt途径正调控因子，其N端的DIX域，可结合Axin，中央区的PDZ域，为蛋白-蛋白相互作用的位点，可结合多种蛋白质，如CKI-ε,CBP/Frat,酪蛋白激酶Ⅱ等，而其C端DEP域则具有调节细胞的极性及移动的作用。 Wnt分泌蛋白及其受体FZD在肿瘤中也可出现异常表达。在结肠癌、胃癌中，可见Wnt2、Wnt5A、FZD1/2表达明显高于正常粘膜组织。但Wnt基因的突变和错义表达与人类肿瘤的直接联系迄今尚待阐明。To等对12例胃癌标本（7例为肠型，4例弥散型，1例混合型）检测Wnt受体FzE3及其相关蛋白hsFRP的变化情况，研究发现，75％病例存在FzE3表达上调，同时也观察到β-catenin，hsFRP和cyclinD异常表达。在胃癌细胞株的研究中发现，FZD2，FZD5，FZD7，FZD8，FZD9在不同的细胞株异常表达；Wnt家族的多个成员在另外一些细胞株也检测出有的情况高表达。 TCF是Wnt途径下游组分，属于DNA结合蛋白，包括1个HMG盒子(highmobilitygroup)和β-catenin作用域。HMG盒子具有与DNA结合的活性，通过与其它因子发生作用，而激活转录活性。有趣的是，TCF转录因子家族的不同成员具有不同的特性。尽管它们都可结合DNA，但在大部分情况下并不能激活转录，只有与β-catenin发生作用后，才可激活转录过程。有报道在结直肠癌中，检测出Tcf-4突变，且同时存在APC或β-catenin的突变，推测Tcf-4突变可能是附加突变。 Wnt途径激活与肿瘤细胞的侵袭和转移癌细胞最为重要的生物学特征是具有侵袭和转移的能力，这是造成恶性肿瘤患者预后不佳和导致死亡的主要原因。癌细胞的侵袭和转移包括以下几个过程：癌细胞粘附性改变，从原发灶脱落，突破基底膜，与细胞外基质作用，侵入周围基质和邻近组织，然后侵入淋巴管或血管，随血流或淋巴，在远部器官或组织建立新的癌细胞集落。在此过程中，涉及到细胞粘附性的改变，细胞外基质的降解，细胞增殖的改变及肿瘤血管形成等。随着对Wnt途径研究的深入，发现Wnt途径异常激活后，其靶基因中有些是与癌细胞的侵袭转移相关的基因，因而推测Wnt途径也可参与肿瘤的侵袭和转移。 细胞间粘附的破坏可促进癌细胞的迁移和浸润，导致侵袭和转移。β-catenin在细胞中起着双重作用：除了参与Wnt信号转导外，还与E-cadherin形成复合物定位于细胞膜，维持细胞间的粘附。在结肠癌研究中发现，在肿瘤侵袭前缘，癌细胞膜上E-cadherin表达基本消失，然而胞核内可观察到β-catenin表达。因而Wnt途径可能影响E-cadherin的表达，利于癌细胞的侵袭。APC的突变也可通过激活Asef，降低E-cadherin介导的细胞间的粘附。靶基因Nr-CAM为免疫球蛋白类粘附分子，参与细胞间的连接，可转化成纤维细胞，肿瘤的侵袭和转移与该靶基因活动性增加亦密切相关。 CD44基因编码合成的CD44属于细胞粘附分子，主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连过程，影响细胞的生长、浸润和迁移，在癌症的生长、淋巴结转移和远距离器官种植方面起着重要的作用。其拼接变异体CD44在正常粘膜上皮不表达，在转移性结肠癌中表达明显增强，且与不良预后有关，在胃癌等肿瘤中也观察到类似情况。有研究表明CD44可明显促进肿瘤细胞的分裂增殖和循环肿瘤细胞在继发器官的定位，并能通过促进ras基因的表达增加迁移蛋白的产生，是肿瘤转移的促进基因。另外，CD44表达阳性的癌细胞可产生免疫逃避，因而容易经淋巴道引起肿瘤细胞的侵袭和转移。虽然CD44在肿瘤转移过程中起作用。 在肿瘤侵袭和转移过程中，细胞外基质的降解是重要的步骤，癌细胞只有破坏细胞外基质才可侵入血管，随血流转移到其它器官。蛋白水解酶可使细胞外基质降解，其中最为重要的是基质金属蛋白酶。MMP-7是蛋白溶解酶家族成员，通过降解基底膜和细胞外基质，促使肿瘤细胞的侵袭和转移。在转移性结肠癌的研究中，应用细胞系、动物模型或人癌标本，均观察到MMP-7的高表达。作为Wnt途径的靶基因，MMP-7不仅在结肠癌中与β-catenin共表达，而且在侵袭前缘，可观察到MMP-7与胞核内β-catenin共存。Wnt途径的靶基因COX-2可增强MMPs的表达，促进肿瘤的侵袭转移。 肿瘤的生长和扩散与血管生成密切相关，启动血管生成是肿瘤增殖的先决条件。目前已发现有十数种促进肿瘤血管生成的生长因子，如VEGF,EGF,TGF,FGF,Angiopoietin等。而Wnt途径对血管的生成具有调节作用，其靶基因VEGF参与血管的生成。COX-2也可增强一些生长因子如PDGF等的表达，APC的突变可提高COX-2的活性。Holnthoner等研究表明Wnt途径可部分介导成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）促进肿瘤的血管生成能力。 虽然没有确切的资料证明Wnt的非典型途径Wnt/Ca2+和平面的细胞极性途径参与肿瘤的发生发展，但它们的激活可间接影响典型Wnt途径中的成分，如Wnt/Ca2+途径可激活PKC,PKC的活化可使GSK3失活，进而抑制β-catenin的磷酸化，使胞浆内β-catenin含量升高，有研究发现PKC活化也可激活JNK。因为PKC是多基因家族，每个成员具有不同的组织表达特异性，因此与典型Wnt途径间的相互关系和影响错综复杂，许多的机制还有待研究。平面的细胞极性途径也可涉及Jun的活化。 应用多种分子生物学方法，通过研究Wnt途径主要组分的基因表达情况，观察有无突变、缺失等改变，例如基因芯片，DNA测序分析，SSCP分析等。通过RT-PCR技术，检测Wnt途径相关基因的mRNA水平，特别是实时PCR技术的出现和发展，使研究的精确性大大提高。传统的Northern杂交因其高敏感性也常用于Wnt途径的研究。 在Wnt途径中最终发挥生物效应的是蛋白分子，因而检测其蛋白表达水平和分布具有重要意义。免疫组化染色即可定量分析，又可定位观察各因子的表达情况，是最常用的方法之一。已经克隆的抗体主要有：β-catenin抗体，APC抗体，TCF4和TCF3/4抗体，Wnt1、Wnt2和Wnt10抗体等，结合western印迹杂交，可以为更加深入研究Wnt途径的作用机制提供条件。 胞外分泌蛋白和受体Wnt基因编码长度为350－400氨基酸的分泌型糖蛋白，含有22－24个半胱氨酸残基。在哺乳动物有16个Wnt家族成员，通过与细胞表面、细胞外基质的联系而体现信使的作用。Wnt的受体分为两种：一是FZD(Frizzled)受体家族成员，是具有7个跨膜片段的受体，其N端富含半胱氨酸，是Wnt蛋白的高亲和力结合位点，目前已发现11种；另一种是低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP5和LRP6，为Wnt配体的共受体成员。 经典WNT信号转导通路经典信号转导通路是Wnt蛋白通过Frizzled(FZD)家族特异受体和LRP5／LRP6辅助受体结合，触发细胞内的信号转导，使β-连环蛋白(β-catenin)聚集的级联反应过程。在经典Wnt信号转导缺乏时，β-catenin与Axin-APC-GSK-31等形成降解复合物，结合后的β-catenin发生磷酸化，进而与泛素化蛋白结合被泛素化降解。在经典Wnt信号存在时,β-catenin将不再被CKI和GSK3β磷酸化，而是在胞浆中聚积并进入细胞核。核内的β-catenin与T细胞因子／淋巴增强因子(TCF／LEF)等转录因子和Legless蛋白(BCL9和BCL9L)及PYGO剖结合形成复合物。TCF／LEF-β-catenin-Legless-PYGO复合物启动靶基因FGF20，DKK1，WISP1，MYC，andCCND1等的转录。 非经典wnt信号转导通路非经典wnt信号是通过fzd家族受体和辅受体ROR2和RYK转导的。在该通路中，小G蛋白(RHOA，RHOU，RAC，和CDC42)和c-junN端激酶是DVL依赖的效应分子，而Nemo样激酶(NLK)和活化T细胞核因子(NFAT)则是钙依赖效应分子。NLK磷酸化TCF／LEF转录因子去抑制经典的wnt信号通路。NFAT转录因子早期胚胎发生和致癌作用转移过程中起作用。非经典Wnt信号被转导到DVL-或者Ca2+依赖的级联反应，并与细胞极性信号通路重叠。 Wnt基因家族成员的wnt-1，wnt-3和wnt-10b都是由MMTV诱发小鼠乳腺癌的过程中活化的痛基因．小鼠wnt-1，wnt-2，Wnt-3a，wnt-5a，wnt-7基因在体外均具有转化细胞的能力．目前研究表明，wnt基因及其受体异常与人类肿瘤的发生可能相关．例如，wnt-2和wnt-5a可能与大肠癌发生、发展有关．DKK-1失活在大肠癌进展中也可能起重要作用． Wnt信号转导通路中与肿瘤发生相关的靶基因一旦经典Wnt信号转导通路被激活，将会使靶基因过度表达，从而影响细胞的增殖、分化，促进肿瘤的发生。第一个被确定Wnt信号转导通路的靶基因是原癌基因c-myc。人们在结直肠癌细胞中发现，因APC突变而形成的p连环蛋白-Tcf4复合体，通过与c-myc基因启动子上Tcf4的结合位点作用，使之活化表达，从而解释了为什么c-myc在结直肠癌许多阶段都处于过表达状态。 cyclinD1是调节细胞进入增殖期的主要因子，目前已被证实为原癌基因。1999年，Osamu等发现，p连环蛋白．Tcf4复合体可与cyclinD1启动子作用，引起其高表达；他们还发现活化的Ras也能通过上述的cyclinD1启动子上不同于Tcf／Lef结合位点的区域来加强cyclinD1转录。此后，在实验性毒物诱发的大鼠结直肠癌中发现cyclinD1过度表达，并与B连环蛋白基因突变有关；反义cyclinD1cDNA的表达，可使结直肠癌细胞生长明显抑制，并能阻止裸鼠中SW480结直肠癌细胞生长，结果表明cyclinD1在肿瘤发生中起着关键作用。 抗凋亡基因survivin在正常结肠上皮隐窝的基部表达，并激活Wnt信号。此外，在结直肠肿瘤中survivin表达增加，表明survivin是Wnt信号转导通路的靶基因。与肠道肿瘤发生密切相关的基因即环氧酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)，可能也是p连环蛋白．Tcf复合物的转录靶基因。Dolmetsch等发现，Wnt-1在小鼠乳腺上皮细胞中的表达，能上调COX-2基因的转录，其mRNA和蛋白水平均升高，前列腺素E2(PGE2)生成增多。 研究表明β-catenin是一个多功能蛋白，它存在于内皮细胞的细胞连接处。当有血管内皮生长因子存在的情况下,β-catenin会发生酪氨酸磷酸化，之后细胞连接松散，细胞活动能力增强。因此，在抑制肿瘤新血管生成方面，血管内皮生长因子则被认为是最主要的抗肿瘤治疗靶点。内皮抑素(endostatin)是XⅧ型胶原的羧基末端片段，是一种特异的血管生成抑制因子。 它能直接作用于内皮细胞，通过抑制血管内皮生长因子阻断细胞连接处β-catenin的作用，来抑制内皮细胞的迁移；另一方面，通过使细胞质中β-catenin降解，来干扰它对基因表达的调节作用，从而达到抑制肿瘤血管的生成。 Wnt信号转导通路的组成Wnt基因属于原癌基因，其编码的Wnt蛋白是分泌性蛋白。在脊椎动物中已发现至少20种，其中人类有l6种。长度大约为350~380个氨基酸。起始为疏水信号序列，其后包含着几个糖基化位点，并且富含半胱氨酸。wnt受体蛋白佛力子(FZ)位于细胞膜上，由FZD基因家族编码，是一族反复7次穿越细胞膜的跨膜蛋白。 β-连环蛋白（β-catenin)是Wnt信号通路中有调控转录活性的关键成员，能在细胞核内与Wnt通路另一成员TCF结合从而激活靶基因的转录。糖原合成激酶3β(GSK3β)是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，起到破坏APC复合体的关键作用。在无Wnt信号时有活性，将磷酸根加到β-catenin的四个N端位点使这些磷酸氨基酸作为β-catenin上的一种标志。在wnt信号存在时，磷酸化β-catenin促使β-catenin降解。APC是一种与结直肠癌发生有关的抑癌基因，能结合wnt途径中的多种成分，如AxinGSK3、β-catenin。APC能刺激β-catenin被GSK3β磷酸化。 在调节β-catenin的稳定性中起负性作用，促进β-catenin的降解。轴蛋白(Axin)起支架蛋白的作用，可使GSK3β靠拢β-catenin而促进β-catenin被GSK3β磷酸化，并促进β-catenin的降解。Dsh使Wnt信号的正调节物，是Wnt途径最上游的细胞内成分。有Wnt信号时被激活起支架蛋白作用。有三个高度保守的结构域在其功能中起重要作用。 Dix域通过与Axin的相互作用在拮抗破坏APC复合体中起直接作用。DEP域通过在细胞中的定位与微管细胞骨架的关系而调控Wnt途径的活性中起重要作用。 酪氨酸激酶(cKk)是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，对Wnt途径起正调节作用。CKIs的表达使β-catenin稳定。T细胞因子／淋巴样增强因子1(TCF／LEF1)是序列特异的DNA结合蛋白，能将β-catenin定位于靶基因的启动子的部位。MYC基因位于wnt途径的末端，属于即刻早期反应基因，是调控细胞周期的主要基因。在正常情况下MYC不仅与细胞增殖有关，与最终阻止细胞增殖的细胞程序化死亡也有很大关系。 Wnt途径的实现Wnt通路是通过调节TCF／LEF1家族的DNA结合蛋白转录性质来调节细胞的行为的。其核心是胞质内β-catenin的稳定性。β-catenin水平低下时，wnt通路关闭。当其水平较高时，wnt通路开放。β-catenin在细胞内水平受两组蛋白质的功能竞争调节。一组为降解蛋白类：APC蛋白复合体，由GSK3β、Axin及APC蛋白组成。 另一组为拮抗蛋白类，包括：Dsh、CKIs、GSK3β结合蛋白(GBP)。在正常未受刺激的细胞中无wnt信号，胞质内β-catenin大部分与细胞膜上钙黏着蛋白结合使之附着于细胞骨架蛋白肌动蛋白上，介导同型胞间黏附。对于少部分的β-catenin，APC复合体中Axin使GSK3β向β-catenin靠拢并与APC一同促使β-catenin氨基末端ser／thr位点被磷酸化进而泛素化。最终被蛋白水解酶所降解。 同时TCF／LEF与多种转录抑制蛋白，如GRO家族成员c末端结合蛋白(ctBP)等结合而阻止Wnt靶基因的表达。当Wnt通路活化时，Wnt与受体FZ结合激活细胞内的CKIs。CKIs使Dsh磷酸化，释放GBP，结合与Axin联系的GSK3β，从而抑制GSK3β对β-catenin的磷酸化降解的作用使未磷酸化β-catenin在胞质中积累并转运到核中，破坏LEF／TCF家族与GRO、GBP抑制蛋白形成的复合蛋白。从而激活转录因子，进一步激活MYC基因开始进行转录，刺激细胞增殖。 Wnt通路的信号活性各种组织器官的发育过程中，都存在Wnt信号的传递在造血系统中Wnt信号对于造血干细胞的自我更新起着重要了的调节作用。将编码β-catenin,IRES-GFP的逆转录病毒以及不含β-catenin的空病毒载体分别感染造血干细胞。发现转有空载体的造血干细胞34％处于细胞周期的S、G2／M期，而表达β-catenin的造血干细胞有58％处于同一期。1.Wnt通路对造血干细胞及造血微环境的调节 转染β-catenin的造血干细胞在体外无血清培养条件下，添加一定量的SLE，经过8~9代的培养，细胞可扩增为原来的100倍，而对照组却无明显增加。完全去除SLE后，转染空载体的细胞75％~80％出现定向分化标志。而转染β-catenin的细胞中仅5％~10％出现分化标志。 这表明有活性的β-catenin可维持造血细胞处于非成熟状态，同时促进造血干细胞的扩增。转染β-catenin的造血干细胞在体外培养1周后，植入非致死剂量照射的小鼠体内，8周后发现，植入125个造血干细胞，就可以完全达到重建造血，而且每只小鼠均达到粒系、T系及B系的重建造血。而植入125个转染空载体的造血干细胞却不能重建小鼠的造血功能。 另外，β-catenin的抑制子Axin的表达可抑制造血干细胞的增殖，降低非致死量射线照射小鼠造血系统的重建能力。此外，在造血干细胞及其微环境中发现了Wnt受体的表达。人类造血干细胞表达，基质细胞也表达FZ-6家族的一些成员。在体外Wnt5a可促进造血干细胞扩增，撤除Wnt5a则造血／祖细胞扩增明显减少，原始细胞形成减少。转染wnt1、Wnt5或Wntl的293细胞条件培养基联合一些细胞因子，如KL、IL-3等可刺激造血干细胞扩增7倍、8倍或11倍。 这些证据表明，造血干细胞及其造血微环境可以接受wnt信号并对其作出反应。而且wnt信号对造血干细胞微环境中各细胞成分的维持有调节作用，以维持造血微环境的稳定。 2.Wnt通路对神经前体细胞的调节在CNS，β-catenin信号能控制神经前体细胞的生长以及细胞增殖与分化的平衡。研究者利用两个条件性的β-catenin突变型等位基因来改变CNS组织中的β-catenin信号：一个剔除β-catenin，另一个过表达有活性的β-catenin；在剔除β-catenin以后，小鼠大脑和脊髓的神经组织成分减少，神经前体细胞群也不能维持，而过表达β-catenin小鼠的大脑和脊髓组织成分则大量增加，神经前体细胞群体增大。 说明β-catenin信号对神经前体细胞池的维持，神经前体细胞的增殖与分化至关重要。神经嵴是脊椎动物神经系统发育过程中一个由多潜能细胞群体构成的迁移性结构。Wnt蛋白参与神经嵴发生，Saint-Jeannet等发现正常情况下表达于神经管背侧域的Wnt-1和Wnt-3a，在爪蟾外植体中通过与noggin和chordin的协同，能诱导神经嵴的形成，表现为神经嵴标志物Krox-20，AP-2及slug的表达； Wnt-1和wnt-3a的过表达将导致神经嵴细胞增多；而GSK-3β的过表达由于抑制了Wnt／β-catenin途径，能导致上述神经嵴标志物分子表达的明显下调。Ikeya等通过抑制Wnt-1和wnt3a的表达，也发现会导致小鼠神经嵴衍生物明显不足，同时背外侧神经管中的神经前体细胞显著减少。 3.Wnt通路对其他细胞增殖分化的调节Wnt信号除了对造血干细胞增殖分化有调控作用时，对其他干细胞也有作用。在对胚胎干细胞的研究中发现，如果APC基因突变则可抑制胚胎干细胞向三胚层组织分化而维持其增殖状态，这一效应主要是通过胞内β-catenin浓度的升高来实现的。间充质干细胞是来源于骨髓的多潜能干细胞，在体外可分化为骨、软骨、脂肪细胞。小剂量的Wnt可以扩增未分化的间充质干细胞，而大剂量的Wnt则抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化，增加碱性磷酸酶的表达。表明其有促进成骨形成起始的作用。 Hussain等通过实验证明，Wnt/β-catenin信号通路对胚肝细胞的增殖分化起作用。将取自小鼠胚胎的肝组织在含有Wnt3无血清的条件培养基中培养。对照组中培养的肝细胞出现结构及增殖能力的丢失，细胞凋亡增加。而在含Wnt3的胚胎肝细胞条件下则表现出细胞数量的增加合类管组织的重排。此外，wnt信号对表皮干细胞、毛囊干细胞等均有不同程度的影响。 4.wnt信号通路与肿瘤的发生癌基因或抑癌基因的突变均可导致正常调控细胞增生的调节途径不恰当的活化，使细胞增生失控而致肿瘤生成。在Wnt通路中任何一步发生障碍都可致癌。其异常情况大致可分为3类：一是组成wnt信号途径的蛋白、转录因子或基因被破坏或变异导致该途径关闭或局部途径异常活跃。二是过多的Wnt信号使整个途径都异常活化，细胞进行不必要的增殖。三是没有wnt信号时，细胞内其它的活动也会通过Wnt途径来刺激或诱发细胞乃至机体不正常反应。已发现wnt信号途径的成分在多种人类癌症中发生突变。 如APC、β-catenin等，这些突变使细胞无能力β-catenin至恰当水平。突变β-catenin会产生功能增加的β-catenin蛋白也可逃避破坏复合体的调节。这些突变的最终结果是Wnt靶基因的组成性激及细胞增生的失控。当β-catenin氨基末端的磷酸化位点被除去后,β-catenin对GSK3β的负调控就不敏感了。人类多种肿瘤的产生与这些磷酸化位点的突变有关。其可能的原因丝磷酸化位点的突变导致β-catenin不能被有效降解。在胞质内过量积聚后进入胞核。无限制地激活下有基因，产生肿瘤。而过度的Wnt信号将破坏抑癌基因，激活重要的原癌基因，并通过wnt途径导致癌症。 Wnt信号途径 Wnt信号转导途径是目前已知的胚胎发育所必须的信号转导途径，同时在肿瘤的发生、发展中该途径也占据着重要的位．现已经证实，该通路的过度激活与多种人类肿瘤的发生有密切的联系，尤其在大肠癌的发生、发展上，目前研究表明，约90％的大肠癌发生与该通路过度激活有关。 大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病呈上升趋势，严重威胁人民生命健康，目前主要采取以手术和放化疗为主的综合治疗，传统的化疗药物对患者的预后也只能起到有限的作用，因此新的分子靶向治疗迫在眉睫。Wnt/β-catenin信号途径在胚胎发育过程以及多种肿瘤的发生、发展中起重要作用．由于其在人类不同肿瘤中的广泛激活，调节细胞的生长、迁移和分化，已被公认为肿瘤发生过程中关键的信号通路之一，尤其在大肠癌的发生、发展上，目前研究表明，约90％的大肠癌发生与该通路过度激活有关．近年研究发现，一些非甾体抗炎药、植物类化合物、酪氨酸激酶抑制剂和血管生成抑制剂等能抑制。Wnt/β-catenin信号途径过度激活，以及针对该途径重要信号分子的小分子抑制剂和基因治疗等分子靶向治疗均显示了很好的抗癌前景。 Wnt/β-catenin通路是高等动物胚胎组织发育分化所必需的关键信号通路，主要参与细胞的增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等⋯。研究表明，Wnt/β-catenin通路在卵巢发育过程中起到了关键性的作用，同时，对正常卵泡的发育以及卵巢的功能产生影响。Wnt信号途径的异常激活也与肿瘤的发生密切相关，有十几种目前已知的高发性癌变源于Wnt信号转导途径的失调。 β-cateninβ-catenin在wnt通路中处于一个中心位置。β-catenin基因位于人染色体3p21其蛋白质一级结构包括3个重要的功能性区域，含150个氨基酸的N端，550个氨基酸的中间重复区域，和含100个氨基酸的e末端。β-catenin的突变主要位于外显子3的33、37、4l、45位密码子。区域末端正是是GSK-3B的结合位点而这些密码子编码的β-catenin蛋白NH2其突变或缺失会导致β-catenin不能与GSK3β结合，而不被降解中间重复区域是β-catenin与多种配体如TcffLEF、Axin、E-钙粘蛋白等结合的重要部位，C末端则和中间重复区域共同参与Tcf/LEF的活化，β-catenin基因结构见图。 β-catenin是一种多功能蛋白，通过形成catenin(α,β,γ)-E-cadherin复合物，参节细胞-细胞黏附以及细胞-ECM间的相互作用。胞浆内游离的β-catenin可被遍在蛋白化，进入蛋白酶系统而降解。胃癌时，常由于E-cadherin的下调而使cadherin-catenin复合体减少，使癌细胞更易于呈现侵袭性。 经典Wnt信号转导途径致癌的关键是该途径任何一个信号分子异常致β-catenin在胞质中累积，继而进入核内激活Tcf-4转录因子，启动靶基因转录，因此经典wnt信号转导途径又称为wnt／β-catenin信号转导途径．我们对wnt／β-catenin信号转导途径与大肠癌发生、发展的关系，以及针对该信号途径的治疗策略做一概述． 经典Wnt／B—cafenin信号途径经典Wnt／β-catenin信号包括胞膜、胞质、胞核信号3部分，可概括为：wnt蛋白与胞膜上的卷曲蛋白(frizzled，Frz)受体及低密度脂蛋白受体相关蛋白(10wdens时lipoproteinreceptorrelatedprotein)LRP．5，LRP．6辅助受体结合；同时wnt和Frz受体的结合被wIF．1，cerberus和FrzB竞争性抑制，而Dickkof家族(DKK．1，DKK．2)通过间接减少可利用的辅助受体LRP的数量来间接抑制Wnt与膜受体的结合【3圳．胞膜上的Wnt信号活化后使胞质内散乱蛋白(dishevelled，Dsh)激活，Dsh被磷酸化，抑制β-catenin降解复合体降解B．catenin；β-catenin降解复合体包括大肠腺瘤息肉蛋白(adenomatouspolyposiscoli，APc)，轴蛋白(axin)，糖原合成酶激酶(glycogensynthasekinase．3B，GSK_3B)和酪蛋白激酶1∥8(caseinkinase，cKlCc)等，β-catenin降解复合体异常(如APC或axin突变等)和β-catenin基因本身突变均可致β-catenin降解障碍，在胞质内积累继而进入细胞核；激活转录因子Tc“／LEF，启动靶基因转录(如c—myc，cyclinDl，MMP-7，FGF-18，EGFR等。 Wnt/β-catenin信号途径在大肠癌发生、发展中的作用wnt基因及其受体异常wnt基因家族至少包含19个富含半胱氨酸的糖化蛋白．wnt蛋白在胞膜上和Frz的7次跨膜受体相结合，同时结合LRP-5和LRP-6。这是Wnt信号通路活化的重要起始信号wnt途径抑制剂wIF-1，Cerberus，FrzB等竞争性抑制wnt与Frz结合，而Dickko镓族通通过过问问接接减减少少叨可利利用用的的辅辅助助受体LRP的数量来间接抑制wnt与膜受体的结合． β-catenin基因异常β-catenin基因(CTNNBl)定位于人染色体3P21．P22，该区域是人类基因组经常发生恶性改变的区域，基因全长23．2kb，共有16个外显子，其mRNA长度为3362个核苷酸残基．β-catenin基因外显子3的第33，37，41，45位密码子编码区域构成的β-catenin蛋白的NH2末端，他是与复合体结合后发生磷酸化的位点，其缺失或突变会导致β-catenin不与复合体结合而免于降解，导致β-catenin在胞质的积聚，游离的β-catenin进入核内与Tcf_4结合，促进相应的靶基因转录，则可促使肿瘤的发生．在大肠腺瘤和大肠癌中有相当比例的肿瘤有β-catenin基因突变，且以外显子3最为常见．在APC基因完整的大肠癌中β-catenin基因外显子3的突变率高达50％．在实验性毒物诱导的动物大肠癌中也可频繁检测到β-catenin基因突变． β-catenin降解复合体异常β-catenin降解复合体的功能在于使β-catenin磷酸化，而后被泛素．蛋白酶体系统降解．APc基因最初是从家族性多发性息肉腺瘤综合征(FAP)患者中发现并克隆的，现在公认为是一个典型的抑癌基因．APC基因与结肠癌发生的关系极为密切，其突变后可导致结肠上．皮细胞过度增生，形成息肉，最终导致肿瘤的形成．大约80％散发性结肠癌中可检测到APc基因缺失突变或失活，而APC基因的缺失或失活被公认为是结肠癌发生的早期axin基因也和APC基因一样起抑癌基因作用．研究发现，一些没有APC和β-catenin基因突变的大肠癌中出现了axin的突变，导致β-catenin的核累积，并与错配修复缺陷密切相关．β-catenin降解复合体任何一个信号分子突变、缺失或功能异常等均可致β-catenin降解受阻从而在胞质内累积，随即游离的β-catenin进入核内，激活靶基因的表达． Tcf-4及其靶基因异常Tcf家族包含4个不同的蛋白Tcf-l，Tcf-2，Tcf-3，Tcf-4／Lef在大肠正常上皮及肿瘤细胞中表达的主要是Tcf-4人Tcf_4(hTcf-4)是人结肠上皮主要的家族成分，其基因编码定位于染色体10q25，包括17个外显子和许多选择性结合位点．Duval在24株大肠癌细胞中发现有12株细胞Tcf-4发生突变，其中有半数发生在基因的3’末端，这些突变基因产物可能减少C-末端结合蛋白的结合．从而增强基因的转录活性，说明Tcf_4基因在结肠癌的发生中起重要作用。且各种原因过渡激活Wnt信号途径后均可致β-catenin在胞质内累积，游离的β-catenin进入核内与Tcf_4结合形成复合物，启动下游靶基因的异常转录从而促进肿瘤发生及细胞周期进程． 这些靶基因多与细胞凋亡、细胞生长、血管生成及肿瘤侵袭转移有关，如c．myc，cyclinDl，MMP-7等．我们通过对β-catenin与c—myc，cyclinDl蛋白在大肠癌的表达情况进行相关分析，结果显示，β-catenin与c．myc，cyclinDl表达均呈明显正相关，提示β-catenin异位表达可能是原癌基因c．myc和cylinDl激活的原因之一，并在大肠癌发生、发展中起重要作用． Wnt/β-catenin信号途径Wnt/β-catenin信号途径目前是公认的与大肠癌等多种肿瘤发生、发展密切相关的信号途径，因此近年国内外学者从多方面研究了针对该信号途径的干预策略，包括多种非细胞毒性药物(如非甾体类抗炎药物，植物类化合物等)对该途径的调控作用，以及针对该途径重要信号分子的小分子抑制剂、分子靶向治疗和基因治疗等． Wnt/β-catenin信号转导通路(图1)在生物进化中极为保守，从低等生物果蝇至高等哺乳动物，其成员都具有高度的同源性，它调节转录辅助因子β-catenin的稳定性并依赖β-catenin基因的表达。Wnt/β-catenin信号转导通路异常与人类疾病有关，包括肿瘤、骨质疏松、衰老和退化障碍等。因此，对wnt/β-catenin信号转导通路的研究不仅有助于理解人类疾病的发生机制，而且可以为疾病的治疗提供一系列新的靶点。目前研究证实，至少有6种Wnt蛋白(Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8和Wnt8b)可以激活wnt/β-catenin信号转导通路。Wnt/β-catenin信号转导通路的活化由细胞质中β-catenin蛋白水平决定。 正常情况下，细胞质中β-catenin由泛素蛋白酶体介导呈降解状态而维持低水平表达，泛素蛋白酶体是由轴蛋白(axin)、大肠腺瘤息肉(adenomatouspolyposiscoli，APC)蛋白、糖原合成激酶3β(glycogensynthesiskinase-3β，GSK-3β)和酪蛋白激酶lα(caseinkinaselct，CK1α)等组成的多蛋白复合物，包括泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。GSK-3β通过磷酸化Ser33、Ser37和Thr41标记蛋白，CK1α通过磷酸化Ser45标记蛋白，使其被E3亚基6β-转导素重复蛋白(β-transducinrepeatcontainingprotein，β-TrCP)识别，介导β-catenin分子的降解，26S的蛋白酶体也随之被降解。 Wnt蛋白通过与细胞表面受体复合物跨膜蛋白／共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)结合启动细胞内β-catenin的聚集。但是，目前对于Wnt蛋白结合Fz／LRP受体后引起细胞信号转导的机制还不十分清楚。多数学者认为，2者结合后，受体复合物下游蛋白即细胞质散乱蛋白(disheveled，Dv1)被磷酸化，抑制GSK-3β和CK1α的活性，并通过固定axin蛋白，破坏多蛋白复合物的形成，最终导致非磷酸化β-catenin在细胞质中聚集，并逃脱β-TrCP的识别，避免了被降解的过程，进而转位到细胞核。在细胞核内，β-catenin与TCF形成复合物。当没有β-catenin存在时，TCF与Groucho相互作用形成复合物抑制转录活性；当β-catenin存在时，则干扰TCF与Groucho的相互作用，与TCF和其他转录辅助因子如CREB结合蛋白(CREBbindingprotein，CBP)共同启动下游靶基因的转录。 非甾体类抗炎药物NSAIDsNSAIDs在大量的流行病学和临床研究资料表明，现有的许多非细胞毒性药物显示良好的抗癌前景，研究最多的是非甾体类抗炎药物，其中包括选择性COx-2抑制剂．许多肿瘤均高表达C0x-2．大量研究表明，NsAIDs抗癌作用机制主要与其抑制肿瘤细胞COx-2表达有关，但同时也有较多研究表明，NsAIDs对不表达COx-2的肿瘤细胞也有较强的抑制作用，因此认为NSAIDs可能通过C0x-2依赖和非依赖机制同时发挥抗癌作用．目前研究表明，Wnt/β-catenin信号途径是多种NSAIDs作用的分子靶点．Dihlmann研究表明，消炎痛(indomethacin)和阿司匹林(aspirin)均可抑制大肠癌细胞β-catenin／Tc蹒录活性和靶基因cyclinDl表达，对β-catenin／Tc复合物形成无影响． Dihlmann研究也表明，阿司匹林可增加大肠癌细胞β-catenin蛋白磷酸化，从而促进β-catenin降解．在人体试验研究也发现，舒林酸(sulindac)的抗癌活性与其抑制FAP患者腺瘤组织β-catenin核表达有关．多种NSAIDs在预防致癌剂诱发的动物大肠肿瘤发生上也起了重要作用，其机制多与其抑制β-catenin核表达密切相关． 植物类化合物流行病学调查显示，大肠癌的发病与饮食结构有关，西方发达国家人群中其发病率明显高于那些以素食为主、进食较少肉类和动物脂肪的人群，如东南亚地区的居民．许多植物多酚化合物，抗氧化剂，脂肪酸等对大肠癌有明显的预防和治疗作用，并能提高放化疗敏感性，减轻放化疗对正常组织的毒性反应．已有研究证实，姜黄素(curcumin)可抑制大肠癌HCTll6细胞的β-catenin／Tcf转录活性和β-catenin／Tcf与DNA结合活性，促进caspase介导的β-catenin降解，并下调靶基因c-myc表达．绿茶和白茶均可抑制转基因小鼠c57BL／6JAPC(Min+)小肠肿瘤发生率，其机制与下调β-catenin，cyclinDl和cc-myc蛋白表达密切相关．绿花椰菜(broccoli)的成分之一莱菔硫烷(sulforaphane)可抑制大肠癌Sw480细胞的β-catenin和cyclinDl表达，下调cyclinDl启动子活性，并诱导细胞生长受阻和凋亡． 植物类化合物拉帕醌呈剂量依赖方式诱导大肠癌HcTll6细胞生长受阻和凋亡，与其激活caspase-3，促进β-catenin降解密切相关．咖啡酸苯乙酯(CAPE)是一种酚类抗氧化剂，广泛存在于多种含树脂的植物和蜂胶中，也能人工合成，是蜂胶抗肿瘤作用的主要活性成分，对肿瘤细胞具有选择性的抑制作用，而对正常细胞几乎没有毒性作用．我们研究发现，CAPE呈剂量和时间依赖方式抑制大肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，并抑制大肠癌细胞的β-catenin／Tcf转录活性和靶基因cyclinDl，c-myc表达，且体内CAPE明显抑制大肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长和促进细胞凋亡． 分子靶向治疗随着对肿瘤细胞信号传导途径研究的不断深入，人们对肿瘤细胞内部的癌基因和抑癌基因等的相互作用，以及他们对肿瘤微环境的影响已经越来越清楚，因此针对肿瘤的特异性分子靶点设计抗肿瘤治疗新方案成为可能．目前已经有mAb治疗、小分子抑制剂、新生血管抑制剂、基因与病毒治疗、细胞载体的靶向治疗等多个肿瘤靶向治疗药物问世． 分子靶向药物通过阻断肿瘤细胞或相关细胞的信号转导，来控制细胞基因表达，从而抑制或杀死肿瘤细胞，靶向药物最大的优点是以肿瘤细胞或与之相关的细胞为靶点，选择性地抑制或杀死肿瘤细胞，而不损伤人体的正常细胞，因而是一类极具发展前景的肿瘤治疗药物．目前还没有针对Wn/β-catenin信号途径的特异性靶向治疗药物，但一些其他靶向治疗药物及实验室研究均显示该信号途径可做为分子靶向治疗的潜在靶点． 小分子抑制小分子抑制剂是分子靶向治疗研究的热点．研究表明，β-catenin不仅受丝氨酸／苏氨酸磷酸化调节，而且也受生长因子介导的酪氨酸磷酸化调节．酪氨酸激酶抑制剂格列卫(Glivec／Gleevec)是一种小分子蛋白，已用于慢性髓性白血病和胃肠道间质瘤的临床治疗．研究发现，格列卫能显著抑制大肠癌细胞增殖，并能下调wnt／β-catenin信号途径转录活性，使β-catenin从细胞核到细胞膜转位，所以β-catenin也是格列卫的潜在靶点．因此格列卫有望进一步开发为大肠癌的辅助治疗药物．血管 内皮抑素(endostatin)是一种由约184个氨基酸组成的多肽，这种天然蛋白质是胶原xVⅢ上的相对分子质量为20kDa的C端片段．其在1997年从血管内皮细胞瘤细胞中被分离出来，是特异的血管生成抑制剂，体内外对多种肿瘤有明显的抑制作用．近年研究发现，endostatin不仅抑制血管生成，体内外对大肠癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞也有直接的抑制作用，对大肠癌抑制作用最强．Hanai报道endostatin是wnt／β-catenin信号途径的有效抑制剂，抑制内皮细胞和大肠癌细胞株的wn/β-catenin信号转录活性，促进β-catenin降解．Lepourcelet通过高通量方法对7000种化合物文库中筛选，发现8种化合物能特异地抑制p．catenin与Tcf-4复合物形成，抑制β-catenin／Tcf-4转录活性，下调靶基因cyclinDl和c-myc表达，从而抑制大肠癌细胞增殖．但其临床应用前景仍需进一步探讨． 病毒和基因治目前国内外肿瘤基因治疗研究领域中，针对抑癌基因p53的重组人p53腺病毒是研究最为深入、进展最快的一种基因治疗产品，临床上也显示了较好的疗效．研究表明P53蛋白可上调泛素E3连接酶Siah-1的表达量和活性，促进和加强β-catenin的降解，阻止该信号途径转录因子Tcf-4的活化：或直接抑制Tcf-4的转录，从而抑制wnt/β-catenin信号途径． 针对wnt/β-catenin信号途径的病毒和基因治疗研究的靶分子主要是该信号途径的关键分子β-catenin和核转录因子Tcf-4．以β-catenin为靶点的基因治疗策略主要是反义寡核苷酸和RNA干扰(RNAi)．研究报道，β-catenin反义寡核苷酸呈剂量依赖方式减少β-cateninmRNA和蛋白表达、Tcf4转录活性和cyclinDl表达，体内外显著抑制APc基因突变的大肠癌细胞增殖. vandeWetering报道，β-cateninsiRNA明显抑制大肠癌Lsl74T细胞Tcf4转录活性，并诱导细胞周期阻滞和促进细胞分化．vernla用非病毒载体0ligofectamine转染β-cateninsiRNA，体内外对APC基因突变或β-catenin基因突变的大肠癌细胞均有明显的增殖抑制作用．Brunori利用大肠癌wnt/β-catenin信号途径异常激活的特点，构建了Tcf-限制复制型溶瘤腺病毒，病毒可在高β-catenin/Tcf-4转录活性的细胞中选择性复制而融解靶细胞，体外显示较好的抑制肿瘤生长作用． 总之，Wn/β-catenin信号转导途径与大肠癌的发生、发展密切相关，针对该信号途径的分子靶向治疗策略有望为大肠癌的治疗提供新的有效途径，非甾体类抗炎药物和植物类化合物等多种非细胞毒性药物也将为大肠癌的预防和，综合治疗起到极其重要的作用． 应用要点分子靶向治疗是肿瘤治疗领域研究的重点方向之一．是一类极具发展前景的肿瘤治疗策略．Wnt/β-catenin信号转导途径与大肠癌等多种肿瘤的发生密切相关，因此可做为分子靶向治疗的潜在靶点． Wnt信号转导通路在肿瘤中的研究进展1982年，在小鼠乳腺癌中发现了Wnt基因，由于该基因激活需依赖小鼠乳腺癌相关病毒基因的插入(insertion)，因此，最初被命名为Intl癌基因。随后的研究表明，Intl基因在小鼠正常胚胎的发育中起重要作用，相当于果蝇的无翅(Wingless)基因，其编码的蛋白在细胞间传递生长和发育信息，可控制胚胎轴向的正常发育。此后，大量研究均提示了Intl基因在神经系统胚胎发育中的重要性。因此，将Wingless与Intl结合，称为Wnt基因。人Wnt基因定位于染色体12q13。在胚胎发育中，Writ基因调控的重要信号转导系统即为Wnt通路。 Wnt信号转导通路有4个主要分支：①经典wnt通路。该通路通过p连环蛋白(β-catenin)在核中累积而启动靶基因⋯。(2)Planer细胞极性通路。涉及RhoA和Jun激酶，调控细胞骨架的重排，其主要作用是对胚胎发育进行阶段性调控。③Wnt／Ca通路。此通路由Wnt5和Wnt11激活，引起细胞内Ca和Ca敏感信号成分的激活，如钙调蛋白依赖的激酶和激活T细胞核因子。该通路能拮抗经典的Wnt通路。④调节纺锤体的方向和非对称细胞分裂的细胞内途径。wnt信号通路的一些分子，如糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinaseo313，GSK·3β)和结直肠腺瘤息肉蛋白(adenomatouspolyposiscoli，APC)，参与某些生物如果蝇和线虫细胞分裂过程中纺锤体方向的确定和非对称细胞分裂。 Wn/β-catenin信号转导通路为靶点的抗肿瘤治疗越来越多的研究表明，Wn/β-catenin信号转导通路与人类肿瘤密切相关。针对Wn/β-catenin信号转导通路中信号分子为靶点的抑制剂已成为抗肿瘤的候选药物。 在细胞外水平阻断Wnt信号Wnt配体本身可通过反义寡核苷酸技术、RNA干扰技术及中和抗体技术等成为抗肿瘤治疗靶点。Wnt信号分子的拮抗剂，如与Wnt信号分子特异性结合的卷曲相关蛋白(frizzled-relatedproteins，FRPs)和DKKs，已成为天然的抗肿瘤药物。DKK蛋白是wnt辅助受体LRP5／6的拮抗剂，具有抗肿瘤潜能，在人类中已发现4种DKK蛋白。Hoang等研究发现，DKK-3及LRP5显性负突变体在肉瘤细胞Saos-2中的表达可明显降低其侵袭和细胞运动能力，并可诱导β-catenin的定位改变及增加细胞间黏附。Gonzalez-Sancho等研究发现，在结肠癌中诱导DKK-I基因的表达可下调Wnt／β-catenin信号。 在细胞质水平靶向wnt/β-catenin信号信号Wnt/β-catenin信号转导通路通过细胞内蛋白一蛋白的相互作用而受到严密调控。由于肿瘤抑制基因APC在结直肠癌中的核心作用，使针对该蛋白的β-catenin结合区域的阻断剂成为有效抑制肿瘤的物质。抑癌基因axin是Wnt/β-catenin信号转导通路的负性调控者，该基因突变是某些肿瘤发生的重要因素。转染野生型axin-1基因可诱导β-catenin聚集的肝癌细胞和结直肠癌细胞凋亡，并抑制其生长。Sekiya等报道，β-连环蛋白／T细胞因子抑制子(inhibitorofbeta-cateninandTceilfactor，ICAT)也可诱导结肠癌细胞发生G2／M期阻滞并诱导细胞凋亡；ICAT与β-catenin相互作用，可干扰细胞核内β-catenin与TCF-4相互作用，负向调控Wnt信号通路。 β-catenin蛋白表达和和降解Wnt信号异常的肿瘤都存在表达水平上调，因此靶向β-catenin的治疗引起人们的广泛关注。目前，反义寡核苷酸技术、RNA干扰技术及蛋白敲除技术处于研究阶段。针对β-catenin的反义寡核苷酸可以减少肿瘤β-catenin蛋白的表达，有效抑制肿瘤生长。 最近一些研究致力于通过降解β-catenin，使其在人类肿瘤细胞中的表达活性降低，从而阻断Wnt信号通路，成为抗癌治疗的一个新靶点。有研究证明，突变的β-catenin可以通过细胞内Skpl／Cullin／F-box(SCF)遍在蛋白化作用机制而被降解。Liu等用嵌合体F-box融合蛋白形式加速了不依赖GSK-3β磷酸化而介导的β-catenin蛋白降解，以达到治疗肿瘤的目的。 在细胞核水平靶向Wnt/β-catenin信号转导通路研究表明，β-catenin／TCF复合物可以成为合理设计和高通量筛选抗肿瘤药物的有效靶点。Lepourcelet等设计出用于鉴别抑制TCF-4与β-catenin相互作用化合物的高通量药物筛选方法。另外，针对β-catenin／TCF复合物介导的下游靶基因也成为抗肿瘤治疗的新靶点，这些靶基因包括c—myc、cyclinD1、PPAR、COX-2、CD44和MMP7等。 综上所述，Wnt／β-catenin信号转导通路在人类肿瘤的发生、发展中起重要作用，以该通路分子作为抗肿瘤治疗靶点已引起众多肿瘤和药物研究者的极大兴趣，随之研发出越来越多的抗肿瘤药物与策略，这些药物与策略从不同水平阻断Wnt／β-catenin信号转导通路而发挥抗肿瘤作用。深刻理解其调控机制，对于以Wnt／β-catenin信号转导通路为靶点的抗肿瘤药物的设计具有重要意义。 β-catenin的磷酸化 Wnt信号途径 wnt/β-catenin通路靶基因各种原因激活wnt/wnt/β-catenin通路后均可致β-catenin在胞质内累积，游离的β-catenin进入核内与Tcf-4结合形成复合物，启动下游靶基因的异常转蒙从而促进肿瘤发生。至今已发现Y30多种WnVl3-catenin通路相关靶基因，如c-myc、eyclinDl、MMP7、CD44、Survivin和VEGF等，且不断发现有新的靶基因存在，这些靶基因多与细胞凋亡、细胞生长、血管生成及肿瘤侵袭转移有关，其中c-myc、cyclinDl是促进细胞增殖基因，Survivin与抗细胞调亡基因，研究证明它们在结直肠癌中表达增高。它们过表达使细胞增殖增加，调亡减少而促进肿瘤增长。 β-catenin基因自身突变β-catenin定位于3p2l，有16个外显子，含3362个核营酸，编码-种胞内核蛋白，β-catenin蛋白分子量为92kd，该蛋白与α-catenin、γ-catenin和p120ctn共同构成连环蛋白家族。它可与E-cadherin、APC蛋白、Tcf以及EGFR相结合，氨基端含有多个GSK-3β和酪氨酸蛋白激酶(tyrosineproteinkinase，TPK)磷酸化位点，其后为β-catenin结合部位，羧基端有活化相应靶基因转录功能。β-catenin与γ-catenin通过分别与E-cadenin胞内肽段结合再和α-catenin结合，介导细胞粘附，同时还参与Wnt途径的信号传导。目前对于结直肠癌β-catenin基因突变情况的研究结果差异较大，10％～50％。在APC基因完整的结直肠癌中β-catenin基因的突变率高达50％。β-catenin基因突变，以外显子3最为常见，它是与复合体结合后发生磷酸化的位点，其缺失或突变会导致β-catenin不与复合体结合而降解障碍，另外β-catenin与E-cadhcrin的结合力下降而不能被束缚在胞膜上，而导致β-catenin在胞质的积聚。游离的β-catenin进入核内与Tef-4结合，促进相应的靶基因转录，则可促使肿瘤的发生。 β-catenin必须与Tcf结合形成有效的转录调节复合体才能够激活靶摹因的转录，Tc家族包含Tcfl、Tcf2、Tcf3、Tcf4和Lef。这些蛋白在胚胎发育中正常表达，但在大部分分化好的组织中表达下调，而其中的某些蛋白可以继续表达于人体内细胞生长活跃的部位，在大肠正常上皮及肿瘤细胞中表达的主要是Tcf4。作为wnt通路的核内信号分子，TCF在Wnt信号调控转录过程中起着分子开关作用。Tcf与β-catenin结合受很多因子控制，例如组蛋白乙酰基转移酶CBP和染色质重组转录因子SWI/SNF复合体等。研究证明Tcf家族的突变及调控因子的改变都能改变靶基因的转录。