番茄热诱导型ftsh基因的分子克隆 表达特性及生理功能

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1、山东师范大学博士学位论文番茄热诱导型ftsH基因的分子克隆、表达特性及生理功能(山东师范大学生命科学学院。济南，250014)摘要FtsH蛋白酶是一种兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性的兼职蛋白，在生物体内具有重要功能。原核生物中的FtsH蛋白酶多为胁迫诱导型；在高等植物中，FtsH蛋白酶与光胁迫、低温以及病害等密切相关，但对其确切的作用机制尚不清楚。己在多种原核生物中发现热诱导的加日基因，而在高等植物中尚未见热诱导胚硼报道。为此，我们构建了热诱导的番茄cDNA文库，通过EST分析从中分离出全长的加上理砉因，

2、将其命名为LeftsH6。对其表达特性研究充分证明其热诱导表达特性；在此基础上，用反向PCR法克隆了该基因的启动子，通过凝胶阻滞和GUS表达分析研究该基因的表达调控特征。另外，我们构建-fLeftsH6基因的过量、胞质定位(无前导序列的LeflsH6eDNA)和反义的真核表达载体并转化番茄，获得了各种转基因株系，以确定番茄热诱导型FtsH的生理功能。主要实验结果如下：1．从热诱导的番茄eDNA文库中分离到全长廊珏基因并进行了特征分析。该基因序列全长2213bp(注册号：AB217916)，包括一个2019bp的读码框，

3、推测的蛋白前体定位到叶绿体中，序列中存在AAA结构域和zn2+结合结构域等已知的金属蛋白酶FtsH家族的特征结构域。在已克隆的基因中，该FtsH与拟南芥AtFtsH6最近源，被命名为LeftsH6。利用农杆菌侵染的方法将含有三印栅信号肽编码序列和g彦的融合基因转化烟草，GFP荧光表达分析发现：GFP在烟草表皮细胞的叶绿体中表达，证实LeftsH6基医]具有叶绿体定位的特性。体外蛋白酶活性分析表明，纯化的FtsH具有蛋白水解活性，能降解酪蛋白但不降解BSA：突变的FtsH(Zn2+结合结构域中的谷氨酸Glu472突变为谷

4、氨酰胺Gin)失去了体外蛋白酶活性。Southem杂交结果表明，该基因在番茄基因组中是单拷贝；Northem和Western杂交均表明该基因表达被热诱导，但其表达不被低温、干旱、盐胁迫、高光等胁迫调节。本研究首次证明了高等植物中存在热诱导自啦赶基因。2．用反向PCR法从番茄基因组中克隆了LeftsH6基因翻译起始位点上游1558bp的启动子序列(注册号：AB218274)，序列分析表明该启动子中除含有典型的TATA盒和CAAT盒之外，还含有几组比较典型的热激元件(HSE)。利用原核诱导表达的热激转录因子HsfA2和放射

5、性标记的fisH启动子片段(包含HSE)进行凝胶阻滞实验，证实LefisH6启动子中的HSE具有与热激转录因子特异结合的能力。将LeftsH6启动子1558bp、587bp和332bp的片段与gus报告基因融合构建真核山东师范大学博士学位论文表达载体(pFl558、pF587、pF332)，转化烟草。对pFl558转基因烟草GUS活性检测表明，该启动子驱动GUS在热激的烟草根、叶片和花中高水平表达。各个发育时期花的子房、柱头、花药和萼片，以及成熟花药的花粉粒均显示高水平的热诱导GUS染色。启动子缺失分析表明，1558b

6、p的启动子介导的GUS热诱导表达是最强的；587bp的启动子区域能够介导GUS的热诱导表达，但明显弱于1558bp启动子；而332bD的启动子片段驱动的GUS热诱导表达最弱。GUS荧光定量分析表明：在转基因烟草叶片中，热诱导的GUS荧光活性在40℃达到高峰，与Northern杂交结果一致。在相同的热激处理条件下，pFl558转化系显示出最强的GUS活性，显著高于pF587和pF332转化系。实验结果充分表明，LefisH6是一个典型的热激基因，其热诱导特性是通过LeftsH6启动子的HSE与热激转录因子的相互作用介导的

7、。3．将LefisH6的全长cDNA序列构建到组成型启动子(CaMV35S)控制的pROK2真核表达载体中，转化农杆菌LBA4404，通过农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄，获得了过量表达LefisH6基因的转基因番茄，通过Southern杂交证实外源基因己整合入番茄基因组，Northern杂交证实，外源fisH基因在常温条件下的番茄转基因株系中呈现组成型表达，不同的转基因株系LeflsH6表达信号强度有差别。过量转基因番茄营养生长正常，但生殖生长出现障碍。首先表现在花粉高度败育，不能正常座果。通过RT-PCR／Southe

8、m杂交证实了在过量转基因番茄的花药中LeflsH6呈现组成型表达；而在未转基因株中，只有在热激条件下花药中才有LeflsH6的表达。LeftsH6基因在番茄花药中热诱导表达特性的改变是引发花粉败育的根本原因。石蜡切片观察表明，转基因番茄的花粉在减数分裂过程中发生异常，出现形状不规则的小孢子。其次，用未转基因番茄株的正常花粉进行人工