i3kakt通路的激活促进her2阳性胃癌曲妥珠单抗的耐药

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1、硕士学位论文肿瘤细胞群体生长分数高，基因组稳定性差，因此在使用了针对某一特定分子的靶向药后，在各种内外源性刺激因子的作用下，肿瘤细胞群体持续不断地动态演进，交互式的信号网络调控体系相互作用，激活了新的生长信号转导通路从而产生耐药。因此，基于精准医学治疗原则在肿瘤药物治疗中的应用，不仅需要在药物使用前明确肿瘤组织的相应分子生物学诊断，也需要通过“液体活检”等手段持续关注研究后续治疗中各种相关信号通路的基因突变，从而探明其耐药机制再据此设计更为有效的治疗方案以更好地杀灭肿瘤细胞达到控制病情进展甚至是治愈的目的。研究目的

2、和意义：由于曲妥珠单抗联合化疗用于治疗晚期胃癌患者的客观有效率仍然不足50％，且大部分接受曲妥珠单抗治疗初始有效的患者往往在一年内产生继发性耐药。因此探究曲妥珠单抗的耐药机制继而为逆转耐药提供相应的理论依据具有重要的临床意义。目前在胃癌中曲妥珠单抗的耐药机制仍未阐明，相关文献报道也较少。本实验从细胞及分子水平研究了其耐药机制，为筛选出一种新的曲妥珠单抗耐药的分子指标以确定更优的目标治疗人群及克服耐药奠定了重要的理论基础。材料与方法：1．Westernblot法进行HER2阳性人胃癌细胞株的筛选运用Westernbl

3、ot法检测4株人胃癌细胞株SGC7901、MKN45、NCI-N87、MKN28的HER2蛋白表达水平，筛选出HER2表达阳性的NCI．N87细胞作为本实验的研究对象用于进一步的实验研究。2．逐步增加剂量法诱导人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞通过逐步增加剂量法诱导建立人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞系NCI—N87／TR，以MTT法检测耐药细胞的半药抑制浓度IC50，并计算耐药指数RJ。3．耐药细胞对化疗药物的交叉耐药111万方数据中文摘要MTT法检测亲代细胞NCI．N87与耐药细胞NCI．N87／TR对5．Fu、DDP、Taxo

4、l3种化疗药物的的IC50，并分别计算耐药指数刚。4．耐药细胞中AKT／p．AKT及PTEN基因和(或)蛋白的表达水平应用Westernblot法检测亲代细胞NCI．N87与耐药细胞NCI-N87／TR中AKT／p．AKT及PTEN的蛋白表达水平；利用实时荧光定量PCR检测NCI．N87与NCI．N87／TRPTEN基因的表达。5．P13K／AKT信号通路的活化与曲妥珠单抗耐药的关系分别以P13K抑制剂LY294002处理或siPl3K转染耐药细胞NCI-N87／TR，应用Westernblot法检测细胞AKT／p

5、．AKT蛋白表达的变化，MTT检测细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。6．PTEN基因转染研究利用DNA重组技术构建真核表达重组质粒pBabe—puro-PTEN，转化大肠杆菌DH5a，经过菌落PCR检测、酶切鉴定、基因测序等方法鉴定出阳性克隆；将上述鉴定出的重组质粒以Lipofectamine2000转染耐药细胞NCI-N87／TR：应用Westernblot法检测细胞PTEN及下游蛋白AKT／p．AKT的表达水平；MTT检测细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。7．统计学方法所有结果均应用SPSS21．0统计学软件(IBMC

6、orporation，Armonk，NY’USA)进行处理。所有实验结果至少重复3次，并且计算出平均值，数据以平均值士SEM的形式报告。显著性差异均是通过单因素方差分析或Student’S．T检验分析而得。各实验结果所得P值<0．05被认为是有统计学意义。研究结果1．HER2阳性人胃癌细胞株的筛选对比4株人胃癌细胞株SGC7901、MKN45、NCI-N87、MKN28的HER2蛋白表达水平发现，NCI．N87的HER2蛋白表达量最高，因此我们选择HER2高表达的胃癌细胞NCI-N87作为研究对象进行下一步的耐药细

7、胞诱导建立。IV万方数据硕士学位论文2．人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞的诱导建立在对NCI-N87细胞培养的过程中，逐步增加曲妥珠单抗的浓度诱导NCI-N87产生耐药性，当曲妥珠单抗诱导浓度逐渐增加至3500p．g／ml时，NCI-N87能够在该培养基中稳定生长并传代，说明已成功诱导建立人胃癌曲妥珠单抗耐药细胞，命名为NCI．N87／TR；以MTT法检测曲妥珠单抗对NCI-N87和NCI-N87／TR的细胞增殖抑制率，并应用统计学软件SPSS计算相应的半药抑制浓度1C50，计算耐药指数RI(RI=耐药细胞IC50／亲本细

8、胞IC50)；结果提示，NCI-N87和NCI-N87／TR的IC50分别为19．7621ag／ml和227．52399／ml，NCI-N87／TR的耐药指数Ⅺ为11．51。3．耐药细胞对化疗药物的交叉耐药MTT检测结果提示，耐药细胞NCI-N87／TR对Taxol和DDP存在交叉耐药(RI=2．03和2．69，尸均为0．000)，对5-FU不耐药(RI=0