生物技术综合实验自编教材

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1、生物技术综合实验指导生物技术综合实验化学与生命科学学院刘杰凤王颖马超董宏坡尹爱国合编2010年8月引言随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力，因为该学科是一门实践性较强的科学。在培养生物技术专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等课程实验。这些实验为培养学生的基础操作能力、提高学生的实际动手

2、能力等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，学生完成实验后没有一个完整的概念。本实验以基因工程、细胞工程和发酵工程实验为基础，组成了生物工程中上游、中游和下游技术。其中每一个部分放弃了原来单独小实验的结构，而改为一个独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系。本讲义分为三个部分，第一部分“DNA重组技术与基因检测芯片技术”；第二部分“动物细胞培养及细胞活性检测技术”；第三部分“发酵工程及分离提取技术”。这些实验采取大实验方法，使学生有一个完

3、整的操作过程，对理解生物工程的上游、中游和下游技术有了感性认识。目录第一部分分子生物学与基因工程实验1实验一质粒的制备1实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳2实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆3实验四感受态细胞的制备5实验五质粒的转化及转化子的鉴定7（一）、热激法转化7（二）、电转化法7实验六植物总DNA的快速少量抽提9（一）、SDS提取法9（二）、CTAB提取法10实验七总DNA质量检测及酶切10实验八PCR技术11第二部分蛋白质的分离、纯化13动物肝脏过氧化氢酶的提取分离纯化13动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化15实验一紫外分光光度法测定蛋白质

4、含量20实验二考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量22实验三过氧化氢酶活力的测定24实验四离子交换柱层析法分离纯化蛋白质26实验五SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量29附录33附录一试剂配方33附录二硫酸铵饱和度常用表36附录三常用缓冲溶液的配制38参考文献39第一部分分子生物学与基因工程实验实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为

5、例，介绍质粒的抽提过程。一、实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。二、实验材料含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。三、实验原理在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用

6、酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。四、实验步骤1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，6037℃摇床~250r/min过夜培养；3.吸取1.5ml菌液，12000g离心2min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；4.加入300μl溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；5.加入300μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5min；6.加入300μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上

7、10min，使杂质充分沉淀；7.12000g离心10分钟；8.吸取800μl上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5min；9.12000g常温离心15min；10.倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3min后倒去上清）；11.室温放置或超净台上风干DNA；12.加40μl灭菌超纯水或TE溶解；13.质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。五、备注质粒检测：电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、28

8、0nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染