克隆抗体的制备及其应用研究进展

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1、单克隆抗体的制备及其应用研究进展燕珊珊摘要:单克隆抗体技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。此外，抗体还可能执行除目前所具有之外的更多功能。本文将就单克隆抗体的制备及其应用研究进展进行论述。关键词:单克隆抗体；基因工程；小鼠骨髓瘤细胞；细胞杂交瘤技术；噬菌体；临床应用抗体是机体免疫系统的重要效应分子，从第一代多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）到第二代单克隆抗体的成功制备，人们投入了大量的临床应用研究，对医学和生物

2、学的发展发挥了巨大的作用。单克隆抗体（monoclonalantibodies，mAbs）技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。目前，制备mAbs的方法中比较成熟的主要有以下几种：1.抗原特异性的B淋巴细胞杂交瘤技术；2.人-鼠嵌合抗体制备技术；3.噬菌体展示技术获得的抗原特异性人源性抗体；4.转基因小鼠制备的人mAbs；5.核糖体展示技术。通过这些方法，我们利用相应抗原靶向构建治疗性抗体，从而达到预防、治疗疾病的目的，促进生物制药学的发

3、展。以下主要是对抗体制备技术的发展及其应用研究进展进行综述。1鼠源性抗体1975年，Kohler和Milstein[1]将小鼠骨髓瘤细胞和经绵阳红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。由免疫B细胞-浆细胞、瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系可分泌单一、特异性、纯化的抗体，且能在选择培养基中生长、无限增值、分裂，同时在选择培养基作用下，利用代谢缺陷补救机理筛选出同时具有两种细胞特征的细胞克隆。这种经过反复克隆而挑选出来的融合细胞所产生

4、的抗体称为单克隆抗体(McAb)。它在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。至今，科学家们已经建立众多鼠源性mAbs来诊断和治疗多种人类疾病。然而作为在人体内的应用，鼠源单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体（humananti-mouseantibody,HAMA）[2]，很大程度上限制了mAbs的临床应用。此外，鼠源性mAbs不能与人类抗

5、体FcRn结合[3]。为了克服以上这些问题，近年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。2人-鼠嵌合抗体嵌合抗体指的是鼠mAbs的恒定区基因被人Abs的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体[4-5]。这样既能保持鼠单抗的特性，又使获得的单抗降低了在人体内的免疫反应。Jones[6]等在20世纪80年代中期首次成功构建了小鼠抗半抗原-4-羟基-3-硝基苯乙酰基己酸(NP)的免疫球蛋白VH基因，并最终获得可特异结合NP的人源化嵌合抗体，再通过定点突

6、变法进行单纯的CDR移植构建，形成第一代人源化抗体。随后还相继研发了阿昔单抗（抗GPIIb-IIIa鼠-人嵌合抗体）、美罗华(Rit-uximab)、Cetuximab(C225，Erbitux)、Zevalin和Bexxa等嵌合抗体，现均已被广泛应用于科学研究与疾病诊断之中。CDR移植抗体，又称改型抗体，它是在嵌合抗体的基础上，利用基因工程技术，进一步用人的FR代替鼠FR，形成的只剩3个鼠源CDR的、更为完全的人源化抗体。由于具有支持作用的FR不仅为CDR的构想提供了环境，还参与抗体结合位点正确构像的形成和抗原的

7、结合，常常使得CDR移植抗体的亲和力和特异性大大降低，有的甚至还丧失了抗原结合能力[7]。通过大量研究，我们发现选用与鼠源单抗具有高度同源性的人源抗体，但保留鼠源单抗中的一些关键氨基酸残基，并在此基础上，对鼠CDR和FR的一些表面氨基酸残基进行修饰或重塑，对关键氨基酸残基进行一定的改变，能在保留CDR移植抗体的亲和力和特异性下，大大降低其免疫原性。因此，相对于嵌合抗体，第二代人源化抗体-CDR移植抗体的人源化程度能达到70%以上，有利于其在临床试验中的应用与研究。3完全人源性抗体为了能使单克隆抗体大量的应用于疾病治

8、疗、临床试验和科研中，我们不仅要降低其免疫原性，还要对其亲和力质量、治疗能力强弱等方面提更高的要求。目前，研究人员已建立多种方法生产完全人源性抗体，主要有噬菌体展示技术和转基因小鼠技术。3.1噬菌体展示技术1985年，SmithGP[8]将外源基因通过基因工程技术插入丝状噬菌体基因组中，从而在噬菌体表面以融合蛋白的形式展示，这一技术即为噬菌体展示技术。该技术