in―fusion克隆技术构建hbvx基因真核表达质粒

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1、In-Fusion克隆技术构建HBVX基因真核表达质粒［摘要］目的：以血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA为模板，克隆构建HBVX蛋白质的真核表达载体pcDNA-HBxo方法：设计扩增HBVX基因的In-FusionPCR引物，采用高保真DNA聚合酶分两段扩增HBVX基因序列；采用In-Fusion克隆技术，将两段X基因扩增片段一步克隆入经HindIII和XbaI双酶切的pcDNA3.0真核表达载体，以构建重组真核表达载体pcDNA-HBX；采用HindIII和XbaI双酶切和DNA序列测序筛选鉴定重组载体；pcDNA-HBx转染HepG2细胞，West

2、ernblot检测pcDNA-HBx转染细胞的HBx蛋白质表达。结果：In-FusionPCR引物分两段扩增获得全长HBx基因序列；In-Fusion获得克隆的pcDNA-HBx经双酶切筛选得到阳性重组质粒，测序分析证实插入序列正确；转染pcDNA-HBX的HepG2细胞，Westernblot证实表达HBx蛋白质。结论：以血清HBVDNA为模板克隆HBVX基因，构建了表达HBVHBx蛋白质的真核表达载体，为HBx蛋白质的生物学功能研究提供支持。［关键词］乙型肝炎病毒；HBVX基因；基因克隆；表达载体；真核表达中图分类号:R511文献标识码：A文章编号

3、:2055-5200(2014)02-001-05慢性乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染是肝癌发生的主要危险因素之一。HBV编码的分子中与肝癌发生关系最密切的是X蛋白质，HBVX基因编码的X蛋白质(thehepatitisBvirusX,HBx)具有多种生物学功能，可与宿主细胞多种蛋白质相互作用，调控宿主细胞基因表达，影响宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化等，其对肝细胞周期与凋亡的影响是HBV致肝癌发生的重要机制之一[1-3]o因此，克隆HBVX基因进行HBx蛋白生物功能研究具有重要意义。由于血清HBVDNAX基因的特殊结构，使

4、得克隆X基因较为困难。血清HBV病毒颗粒的基因组长约3.2kb,为带有缺口的双链不完全环形结构DNA,称为松弛环状DNA(rcDNA),而X基因位于HBV基因组的1374bp〜1838bp,正位于缺口处,而且该区域为高CG区。实验发现：当以血清HBVrcDNA为模板时，用普通PCR-次扩增全长X基因，或用PCR分段扩增后再用PCR扩增拼接的X基因，所获得全长X基因扩增片段经常会出现序列缺失现象[4]。为克服上述问题，我们釆用In-Fusion克隆技术，将分段扩增的X基因片段一次连接克隆入真核表达载体中。In-Fusion克隆技术是利用In-Fusion

5、Enzyme可准确将末端带有15个相互重叠碱基序列的DNA片段融合连接的特性，将一个或多个外源基因片段一次克隆入目的质粒中[5-6]o目的克隆基因片段末端的15bp重叠碱基序列，是通过特定设计的In-Fusion引物加到扩增片段的末端。In-FusionHDCloningKits试剂盒可快速准确地将一个或多个外源DNA片段克隆到载体任何位置[7-8]o采用In-Fusion技术，以血清HBVDNA为模板，分段扩增并拼接X基因，将X基因准确地克隆入真核表达载体pcDNA3.0,获得了可表达HBx蛋白质重组真核表达载体。为HEx蛋白质的生物学功能研究提供实

6、验条件。1材料与方法1.1主要实验材料及仪器表达载体pcDNA?3.0购自美国Invitrogen生命技术公司；高保真PCR扩增反应液2XPfuPCRMasterMix.TIANamp病毒DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶DNA回收试剂盒、感受态ToplO购于天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶Hindlll和XbaI、In-FusionHDEcoDryTMCloningKit购自宝生物工程（大连）有限公司；HepG2细胞株购于中国典型培养物保藏中心；鼠抗HBxAg单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体购于圣克鲁斯（SantaCruz）生

7、物技术公司；NanoDrop2000核酸浓度分析仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）。根据HBVrcDNAX的结构特点，拟分HBX1和HBX2两个片段扩增X基因，然后进行In-Fusion融合连接克隆，所用扩增引物（表1）用http://bioinfo,clontech.com/infusion/在线软件设计；化学发光底物（BeyoECLPlusReagentA,B,D3308）o表1用于In-Fusion分段拼接克隆的PCR引物序列引物引物序列HBV基因组位置P1GTTTAAACTTAAGCTTCTTACCATGGCTGCTCGG1368-1385ntP

8、2GTGGTCTCCATGCGACGTGCAG1618-1597ntP3TCGCATGGAGA