hbvx基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响

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1、HBVx基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响　　摘要:目的构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体并在肝癌细胞中表达，以研究其对肝癌细胞恶性表型的影响.方法应用PCR、基因克隆等方法构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX，用基因转染的方法将pcD-NA3.1-HBX转染入肝癌细胞HCC-9204，筛选稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞.MTT比色实验、平板集落形成实验检测肝癌细胞恶性表型.结果成功构建了乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX并获得了稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞系HCC-9204细胞克隆，且MTT比色实验、平板克隆

2、形成实验显示稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞恶性度增高.结论乙型肝炎病毒X蛋白具有生长因子样作用，可刺激肝癌细胞生长，在肝癌细胞中稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌细胞恶性表型.　　Keyacell　　Abstract:AIMToconstructandexpresstheeukaryoticex-pressionvectorofHBVxgeneandstudyitseffectonthema-lignantphenotypeofhepatocellularcarcinomacells.METHODSPolymerasechainreaction（PCR）andotherm

3、olecularbiologicalmethodsediatedbythelipofectamineanhepatocellularcarcinomacelllineHCC-9204.TheselectivemediumcontainingG418etricanalysisexperimentandagarosecolony-formingalignantphenotypeandgroacells.RESULTSTheeukaryoticexpressionvectorofHBVxgeneediumcontainingG418.Cellsalignantphenotype.CON

4、CLUSIONTheXproteinhasgroulatethegroacellsandenhanceitsmalignantphe-notype.　　0引言　　乙型肝炎病毒（HBV）相关的原发性肝癌发病率和死亡率都很高，HBV与原发性肝癌之间存在着密切的关系.阐明二者的关系将对探讨HBV相关的原发性肝癌的发生、发展、预防及治疗具有重要意义.为此，本研究首先构建了HBVx基因真核表达载体，并通过基因转染技术转染至人HCC-9204肝癌细胞，经过药物筛选获得稳定表达HBVX蛋白的细胞克隆，观察肝癌细胞在转染外源性HBVx基因后细胞恶性表型的变化.　　1材料和方法　　1.1材料人肝癌

5、细胞系HCC-9204为病理学教研室建株.肝癌细胞取自60岁男性肝癌患者手术标本，病理诊断为肝细胞肝癌Ⅱ～Ⅲ级.MTT购自Sigma公司，TaqDNA聚合酶、G418购自Promega公司，EcoRI，KpnI，BamHI，T4DNA连接酶为华美公司产品，兔抗HBx多克隆抗体购自美国FoxChase癌症中心，地高辛DNA随机引物标记试剂盒购自德国宝灵曼公司，HBVx基因PCR引物由上海生工生物工程公司合成.　　1.2HBVx基因克隆及序列测定　　1.2.1PCR法从质粒pTTHK中扩增HBVx基因模板为含HBVDNA的质粒pTTHK，分别在PCR引物的上游引物和下游引物的5’端加

6、上相应的限制性内切酶KpnI和EcoRI酶切位点，引物顺序如下:上游引物5’ATCGGTACCATGGCTGC-TAGGCTG3’;下游引物5’GGAGAATTCAT-GATTAGGCAGAGGTG3’.应用上述引物对模板DNA进行PCR，按下列条件在PCR自动扩增仪上进行PCR.94℃5min→59℃1min→74℃1min，循环30次后，74℃延伸10min.阴性对照除不含模板DNA外，其他成分与实验组相同.　　1.2.2PCR产物与克隆载体pT7Blue连接先用EcoRV将克隆载体pT7Blue切成线性，然后将回收的PCR产物HBxDNA片段接于克隆载体pT7-Blue.取

7、连接产物转化感受态细菌DH5α大肠杆菌，挑选单菌落，筛选重组体.　　1.2.3筛选重组体pT7Blue-HBX取上述质粒用EcoRI和KpnI双酶切鉴定.　　1.2.4序列测定选择酶切结果正确的细菌菌落，提取质粒DNA并纯化.用紫外分光光度计测定DNA浓度，将5～10μg质粒DNA溶于三蒸水，用DNA自动测序仪进行序列测定.　　1.2.5真核表达载体pcDNA3.1-HBX的构建将已经过序列测定的重组质粒pT7Blue-HBX及真核表达载体pcDNA3.1分别用EcoRI和Kpn