hbvx基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响论文

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1、HBVx基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响论文.freelacellAbstract:AIMToconstructandexpresstheeukaryoticex-pressionvectorofHBVxgeneandstudyitseffectonthema-lignantphenotypeofhepatocellularcarcinomacells.METHODSPolymerasechainreaction（PCR）andothermolecularbiologicalmethodsediatedbythelipofectamineanhepatocellularca

2、rcinomacelllineHCC-9204.TheselectivemediumcontainingG418etricanalysisexperimentandagarosecolony-formingalignantphenotypeandgroacells.RESULTSTheeukaryoticexpressionvectorofHBVxgeneediumcontainingG418.Cellsalignantphenotype.CONCLUSIONTheXproteinhasgroulatethegroacellsandenhanceitsmalignantphe-notype

3、.0引言乙型肝炎病毒（HBV）相关的原发性肝癌发病率和死亡率都很高，HBV与原发性肝癌之间存在着密切的关系.阐明二者的关系将对探讨HBV相关的原发性肝癌的发生、发展、预防及治疗具有重要意义.为此.freela公司，TaqDNA聚合酶、G418购自Promega公司，EcoRI，KpnI，BamHI，T4DNA连接酶为华美公司产品，兔抗HBx多克隆抗体购自美国FoxChase癌症中心，地高辛DNA随机引物标记试剂盒购自德国宝灵曼公司，HBVx基因PCR引物由上海生工生物工程公司合成.1.2HBVx基因克隆及序列测定1.2.1PCR法从质粒pTTHK中扩增HBVx基因模板为含HBVDNA的质粒

4、pTTHK，分别在PCR引物的上游引物和下游引物的5’端加上相应的限制性内切酶KpnI和EcoRI酶切位点，引物顺序如下:上游引物5’ATCGGTACCATGGCTGC-TAGGCTG3’;下游引物5’GGAGAATTCAT-GATTAGGCAGAGGTG3’.应用上述引物对模板DNA进行PCR，按下列条件在PCR自动扩增仪上进行PCR.94℃5min→59℃1min→74℃1min，循环30次后，74℃延伸10min.阴性对照除不含模板DNA外，其他成分与实验组相同.1.2.2PCR产物与克隆载体pT7Blue连接先用EcoRV将克隆载体pT7Blue切成线性，然后将回收的PCR产物HB

5、xDNA片段接于克隆载体pT7-Blue.取连接产物转化感受态细菌DH5α大肠杆菌，挑选单菌落，筛选重组体.1.2.3筛选重组体pT7Blue-HBX取上述质粒用EcoRI和KpnI双酶切鉴定.1.2.4序列测定选择酶切结果正确的细菌菌落，提取质粒DNA并纯化.用紫外分光光度计测定DNA浓度，将5～10μg质粒DNA溶于三蒸水，用DNA自动测序仪进行序列测定.1.2.5真核表达载体pcDNA3.1-HBX的构建将已经过序列测定的重组质粒pT7Blue-HBX及真核表达载体pcDNA3.1分别用EcoRI和KpnI双酶切，用DNA回收试剂盒回收并纯化HBx和pcDNA3.1片段，T4DNA连

6、接酶进行连接.EcoRI和KpnI双酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-HBX.1.3基因转染及筛选用脂质体载体法将经聚乙二醇6000纯化的pcDNA3.1-HBX和pcDNA3.1质粒分别转染HCC-9204肝癌细胞，参照GIBCORL说明书进行.接种细胞于选择性培养液含G418700mgL-1，培养1gL-1的培养液继续培养.同时设对照，用选择性培养液培养未进行基因转染的亲本细胞.1.4HBVx基因在肝癌细胞中的表达原位杂交法检测转染pcDNA3.1-HBX质粒的第四代肝癌细胞中HBVxmRNA，探针用DNA随机引物法进行标记.对照实验:设未转染肝癌细胞为阴性对照，不加探针的空白对照.免

7、疫荧光法检测经G418筛选的转染pcDNA3.1-HBX或pcDNA3.1质粒的第四代肝癌细胞中X蛋白.对照实验:空白对照分别用PBS代替一抗或二抗.阴性对照为未进行基因转染的HCC-9204肝癌细胞爬片.1.5转染pcDNA3.1┐HBX质粒对肝癌细胞恶性表型的影响1.5.1四唑盐（MTT）比色试验将未进行基因转染的HCC-9204肝癌细胞，转染pcDNA3.1空载体的肝癌细胞及稳定表达X蛋白的肝癌细胞，阿霉素诱导细胞