db37t3127-2018禽波氏杆菌凝集试验和间接elisa抗体检测技术规范

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1、ICS11.220B41DB37111东地方标准DB37/T3127—2018禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范TechnicalGuidelineofAgglutinationTestandIndirectELISAforAntibodyDetectionofBordetellaavium2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局发布本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、

2、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、刘红红、王敏。禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范1范围本规范规定了禽波氏杆菌凝集试验和I'可接ELISA抗体检测技术的术语和定义、试剂或材料、仪器设备，利用平板凝集试验、试管凝集试验和间接酚联免疫吸附实验（iELTSA）检测禽波氏杆菌抗体的方法和技术要求。木规范适用于禽场禽波氏杆菌的流行病学调查、诊断和疫情监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注

3、日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T603化学试剂试验方法屮所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1禽波氏杆菌Bordetellaavium,B.avium是波氏杆菌属（ThegenusBordetella）四个种中的一个新种,1984年由Kersters确认。3.2试管凝集试验tubeagglutinationtest常用已知已定暈的抗原与一系列稀释的禽的血清混合，在保温放置后观察结果，以判定受检

4、血清有无相应抗体及其效价。多用于半定量和定量试验。3.3间接酶联免疫吸附实验indirectenzyme-1inkedimmunosorbentassay,iELISAELISA是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。iELISA是基于ELISA反应原理设计的，包被抗原后加入待测抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反应后再洗板，加入底物显色。4试剂或材料4.1禽波氏杆菌标准株禽波氏杆菌P5株，购自屮国兽医药品监察所。4.2禽波氏杆菌阳性血清SPF鸡经免疫禽波氏杆菌抗原三次后获得的血清，每次免

5、疫间隔两周。4.3阴性血清从SPF鸡分离的血清。4.4待检禽血清采集禽的血液，于37°C温箱中静置2h,收集析出的血清。4.5生化试剂灭菌0.5%石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCl＞牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制方法见附录A）。5仪器设备5.1平板（玻板、白瓷板或载玻片）。5.2微量移液器：量程为20M〜100口。5.3接种坏。5.4试管架。5.5小试管（口径8mm〜10mm）。5.6灭菌吸管（1mL）o5.7恒温培养箱。5.8匀速振荡器。5.996孔EL1SA酶标板。5.10酶标仪（波长范围340n

6、m〜850nm）。6禽波氏杆菌抗体检测平板凝集试验6.1用20M微量移液器分别吸取三滴禽波氏杆菌P5株标准抗原于平板上。6.2再分别取禽波氏杆菌阳性抗体、阴性血清和待检禽血清各一滴加入上述抗原液中，并用接种环混合均匀，3min〜5min观察结果。6.3平板凝集试验可参考图1：阳性抗僚阳性血淸阴性血淸待检血淸图1平板凝集试验图示6.4结果判定：6.4.1阳性血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，阴性血清与阳性抗原作用后仍均匀混浊，试验结果有效。6.4.2待检禽血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，则判为阳性。6.4.3待检禽血清与阳

7、性抗原作用后均匀混浊，则判为阴性。6.4.4待检禽血清与阳性抗原作用后介于阴阳性之间，判为可疑。7禽波氏杆菌抗体检测试管凝集试验7.1被检禽血清稀释度设定通常情况下，用1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度；大规模检疫吋，可只用前两个稀释度。7.2血清的稀释及抗原的加入7.2.1血清的稀释7.2.1.1为每份血清准备小试管5支，第一管加入2.3mL石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四、五管各加入0.5n）L石炭酸生理盐水。7.2.1.2用1mL吸管吸取被检血清0.2mL,加入第一管中,并混合均匀,然后用吸管吸取混合液

8、0.5mL,加入到笫二管屮，混合均匀，再吸取混合液0.5mL加入到第三管，同样混匀，从屮吸HZ0.5mL加入第四管混匀，再从第四管吸取0.5汕加入第五管，第五管混匀后弃去0.5mho这样稀释之后，从第二管到第五管，血清稀释度分别为1:12.5s1: